血管のCaの可視化 ^{2 +}パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

本手順の全体的な目的は、ペリクリン由来の活性酸素種（ROS）によって誘発される血管内カルシウムシグナリングを可視化することです。これはまず、活性化マクロファージにおいて酸化感受性染料を用いてROSを可視化することによって達成されます。また、プラスミドベースの蛍光センサーを用いることで、内皮細胞におけるROSを可視化することも可能です。

次に、共培養モデルにおいて、CellTracker Redで標識した活性化マクロファージとFluo-4で標識した血管内皮細胞を同時に可視化します。最後に、共焦点イメージングシステムを用いて、マクロファージ由来のROSによって誘発される血管内皮細胞内のカルシウムシグナリングを測定します。

これらの結果により、ROSレベルを独立して実証できるだけでなく、Peregrine由来のROSによって誘発される細胞内カルシウム動員の同時評価が可能になります。本手法は、血管シグナリングおよびシミュレーター病態生理学的環境を密接に引き起こす2つの異なるシグナル分子の同時評価を可能にします。私の研究室のポスドクであるKarthikとRajが、ROSおよびカルシウム測定、ならびにマクロファージと内皮細胞の相互作用に関する手順を実演します。

マウス単球由来マクロファージを底面ガラスの35 mmディッシュで培養します。次に、Toll様受容体アゴニストで細胞を刺激し、37 °Cで6時間インキュベートします。細胞質の可視化のためには、

ROS酸化感受性色素を添加し、細胞を20分間インキュベートします。次に、共焦点イメージングシステムの温度制御ステージ上で細胞を可視化します。あるいは、TLR活性化細胞におけるミトコンドリアROSを可視化するには、ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターを添加し、37 °Cで30分間細胞をインキュベートします。

陰性対照として、細胞をPBSで処理し、陽性対照としてDMSOで処理します。また、2 mMのアンチマイシンで細胞を処理します。その後、共焦点イメージングシステムの温度制御ステージ上で、すべての細胞を可視化します。

ImageJソフトウェアを使用して、すべての画像データを解析します。この蛍光センサーは、サブマイクロモル濃度の過酸化物を特異的に検出し、哺乳類での発現に基づき、ベクター設計によって細胞質またはミトコンドリアのいずれかを標的とすることができます。エレクトロポレーションを用いて、適切な高発現プラスミドを保持するマウス肺微小血管内皮細胞の安定細胞株を作成します。

コロニーの増殖を促進するため、細胞を低密度で完全TMEM培地に播種し、48時間インキュベートした後、培地を選択抗剤を添加した完全培養培地に交換します。ハイパーポジティブ細胞の割合が最も高いクローンをスクリーニングし、培養を拡大して、個々の実験に用いる安定したハイパーポジティブ株を作成します。細胞を0.2%ゼラチンコートしたカバーガラスに播種し、コンフルエンスが80%になるまで一晩培養します。

次に、TLRリガンドで細胞を活性化し、37 °Cで6時間インキュベートします。細胞質ROSを検出するために、細胞が載ったカバーガラスをadeloセルチャンバーに取り付けます。あらかじめ温めておいたハンクス平衡塩溶液を1 mL加え、チャンバーを共焦点イメージングシステムの温度制御ステージ上に配置します。

ミトコンドリアROSを検出するため、細胞の蛍光変化を記録します。ポジティブコントロールとして2 µMのアンチマイシンAを含めてください。次に、処理した細胞のカバーガラスを調製し、共焦点顕微鏡で観察します。ImageJソフトウェアを用いて画像解析を行ってください。

細胞内カルシウム変化の可視化および測定のため、ゼラチンコートしたガラスカバースリップ上で80%コンフルエントにまで増殖させた内皮細胞を用意します。色素の損失を最小限に抑えるため、室温で蛍光色素flu oh 4:00 AMを用いて細胞を30分間インキュベートし、suen pyro zoneを含む実験用イメージング溶液で細胞を洗浄します。次に、800 µLの予熱した実験用イメージング溶液を用いてカバースリップをadeloセルチャンバーにマウントし、共焦点イメージングシステムの温度制御ステージ上に細胞を配置します。

500 ng/mLのcell tracker red C-M-T-P-Xを用いて、標的となるマクロファージ集団を15分間標識し、細胞を洗浄した後、ペレットを200 µLの実験用イメージング溶液で再懸濁します。次に、標識したマクロファージを、Fluo-4 AMをロードし共焦点チャンバーアセンブリ内に配置した内皮細胞に添加します。緑色および赤色の蛍光を3秒ごとに10分間記録します。

本実験では、J 7 74 0.1細胞にTLR 2、3、および4のリガンドを6時間作用させました。代表的な共焦点画像では、DCFによる測定で細胞質ROSの増加が示されています。興味深いことに、MitoSOXの赤色蛍光により、ミトコンドリアROSにおいても同様の増加が示されました。

これらの蛍光変化は定量的なものです。したがって、結果は標準化し、処理あたりの相対的な倍率変化として表す必要があります。アンチマイシンAのシグナルは、ミトコンドリアROS産生のポジティブコントロールとして検証されます。この図は、hyper cytoまたはhyper D mitoを安定的に発現させた細胞における、内皮、細胞質、およびミトコンドリアの過酸化水素レベルの画像を示しています。

TLRアゴニストで刺激したMP ECS。平均蛍光変化の定量により、共培養システムにおける6時間の刺激後、hyper cytoおよびhyper D mitoの蛍光が増加することが示されています。Peregrine ROSシグナリングを評価するため、野生型およびGP 91 Fox欠損マウスの両方から新鮮に単離したmirinマクロファージを、1 µg/mLのLPSで6時間活性化させました。

マクロファージをC-M-T-P-Xで赤色に標識し、緑色蛍光負荷したMPM ECSに添加しました。興味深いことに、野生型マウスから単離したLPS活性化マクロファージは、GP 91 Fox欠損マウス由来のマクロファージと比較して、MPM ECSにおいて大規模かつ急速なカルシウム動員を誘発しました。

この手順を実施する際は、長時間のダウンタイムやレーザー照射がDCFの自動酸化を招くことに留意することが重要です。Hyper CytoおよびHyper D Mitralの光退色を避けることが不可欠です。習熟すれば、適切に実施することで、マクロファージおよび血管内皮細胞におけるRA測定を7時間で完了させることができます。