モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

本実験系は、特定のタンパク質が浸潤プロセスにどのように寄与しているかを明らかにすることを目的としています。まず、目的の蛍光タンパク質をレトロウイルスを用いて細胞に導入します。また、トランスウェルインサート内にマトリゲルタンパク質の3Dマトリックスを作成し、細胞懸濁液を適切な希釈倍率で調製します。

Matrigelトランスウェルシステムを用いて、試験薬または処理による化学誘引物質への透過遊走反応を測定し、共焦点顕微鏡によって細胞浸潤を可視化および解析します。最終的に、これらの結果から、三次元タンパク質マトリックスへの細胞浸潤の程度と様式を決定できます。従来のトランスウェル浸潤アッセイなどの既存の手法と比較した本手法の優位性は、三次元タンパク質マトリックスへの細胞浸潤に関する定量的および定性的データの両方を得られる点にあります。

共同研究者のDiane Creightonが、レトロウイルスパッケージング細胞を10%FBS含有DMEMで48時間培養する方法について実演します。製造元の指示に従って、レトロウイルスDNAを細胞に導入してください。24時間インキュベートし、ウェルを培地で2回洗浄した後、各ウェルに10%FBS含有DMEMを1.5 milliliters加え、48時間インキュベートしてパッケージ化されたレトロウイルスを回収します。

組織培養液を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離して細胞をペレット化し、上清を清潔なチューブに回収します。このレトロウイルスストックを-80 °Cで保存します。次に、レトロウイルスを導入する細胞について、一晩培養した培地を除去し、Polygreenを添加した1 mLのレトロウイルスストックを加えます。

6時間のインキュベーション後、ウェルに10%F-B-S-D-M-E-Mを2 mL加え、プレートを37 °Cのインキュベーターに入れる。一晩後に培地を補充し、24時間後に適切な選択培地を添加する。細胞がコンフルエントになったら回収し、非導入細胞をリファレンスとして蛍光によるソーティングを行う。非導入細胞よりも高い蛍光を持つ細胞を回収し、将来の使用に備えて-80 °Cで分注して凍結保存する。

この手法は、可視化のために蛍光タンパク質の発現を利用しており、個々の細胞の寄与に関する知見を得ることが可能です。Matrigelを氷上で融解させ、氷冷PBSで1:1に希釈します。次に、未コーティングのトランスウェルを24ウェル組織培養プレートに挿入します。

次に、希釈したMatrigelを各ウェルに100 µLずつ慎重に分注し、37 °Cで凝固させます。その間に、通常の増殖培地を用いて蛍光標識した細胞懸濁液を調製します。Matrigelが凝固したら、トランスウェルを反転させ、フィルターの出力側である下面に細胞懸濁液を100 µL分注します。

24ウェル組織培養プレートの底面をトランスウェルに慎重に被せ、細胞懸濁液の各液滴に接触させます。細胞を接着させるため、プレートを逆さまの状態で4時間インキュベートします。その後、プレートを正立させ、各トランスウェルを1 mLの無血清培地に2回浸して洗浄します。

次に、薬剤または処理試薬を含む3つ目のウェルにトランスウェルを配置します。化学遊走物質を含む培地100 µLを、凝固したMatrigel-PBS混合物上のトランスウェル内に緩やかにピペッティングします。Matrigelに浸潤した非蛍光細胞をイメージングするため、37 °C、5% CO₂条件下で3〜5日間インキュベートします。

トランスウェルを新しい24ウェルプレートに設置し、各Matrigelプラグの上に4 µMのcalcium AM溶液を1 mLずつピペッティングし、側面から溢れさせて上下両面から染色されるようにします。5% CO₂加湿雰囲気下、37 °Cで1時間インキュベートします。その後、共焦点顕微鏡で撮像します。

この最初のライフスタイル染色法により、浸潤様式の可視化が可能になります。各トランスウェルを新しい24ウェルプレートに移し、4% パラホルムアルデヒドおよび 0.2% Triton X 100 を 1 mL 加え、室温で30分間インキュベートします。1 mL の PBS で3回洗浄した後、0.01 mg/mL の RNAse A を加えて30分間静置し、その後 PBS で2回洗浄して可視化を行います。

PBSで希釈したプロピジウムヨードを加え、室温・暗所で30分間放置します。PBSで3回洗浄します。この段階で、プロピジウムヨードで染色したトランスウェルは、室温・暗所で少なくとも1か月間保存することが可能です。

2つ目の細胞染色法では固定が必要ですが、浸潤のより迅速な定量化が可能です。少量の残留PBSを滴下したトランスウェルを、非浸漬用の20倍対物レンズ上の大きなカバーガラスに配置し、倒立共焦点顕微鏡を用いて、Matrigelプラグの底部から10～15 µmごとに光学切片をキャプチャします。個々の光学スライスを用いて浸潤の程度を定量化してください。また、Velocityなどの適切なソフトウェアを用いて、これらの光学スライスシリーズから3次元オブジェクトを構築します。なお、本手法における細胞はCalcein AMで染色されました。

予想通り、フィルターから上方に浸潤する細胞数は、距離とともに減少します。この浸潤は定量化することが可能です。細胞浸潤の3次元再構成により、浸潤様式を視覚的に描写できます。

蛍光タンパク質の発現により細胞がラベルされている場合、各色の細胞の位置を、この側面図に示すような3次元再構成で視覚化できます。さらに、再構成した画像をスライスすることで、分子メカニズムに関する知見を得ることができます。このビデオを視聴することで、標準的な手法よりも詳細な浸潤プロセスの情報を得るために、この細胞浸潤アッセイをどのように活用すべきかについて、十分な理解を得られるはずです。