大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと生体外線維芽細胞

この手順の全体的な目標は、浸潤性腫瘍前部の悪性上皮細胞と癌関連間質細胞との間の界面における独特の生物学を特徴付けることです。これは、最初に結腸インプラントから初代線維芽細胞培養を確立することによって達成されます。第2ステップは、初代結腸線維芽細胞と培養結腸直腸癌細胞を用いて器官型共培養モデルを構築することです。

次に、器官型モデルをホルミンで固定し、メンブレンマウントスライド上に切片化し、クレスタルバイオレットで染色します。最後のステップは、浸潤している腫瘍細胞を非浸潤腫瘍細胞および癌関連間質細胞から分離するためのレーザーマイクロダイセクションです。最終的には、分子プロファイリング技術を使用して、周囲の腫瘍微小環境における浸潤性腫瘍細胞および非浸潤性腫瘍細胞および間質細胞の生物学を特徴付けることができます。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、結腸直腸癌の三次元器官型共培養モデルで、浸潤細胞と非浸潤細胞がどれほど明確に区別できるかに気付いたときでした。まず、実験室の外科手術室から直接、正常なヒト結腸粘膜組織のサンプルを採取します。10 cmの組織培養皿の中央に標本を置き、ペニシリン、ストレプトマイシン、真菌ゾーンを添加したリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで培養物を3回洗浄します。

滅菌鉗子とメスで最終洗浄した後は吸引せず、組織を細かく切ってください。次に、メスの刃で描かれた十字の中央に各ピースを置きます。12ウェルプレートでは、メスを組織上にそっとさらと動かし、培養物に付着させます。

標本は750マイクロリットルの一次線維芽細胞増殖培地に入されており、組織が浮かぶことなく組織を沈めるはずです。次に、次の5日間で試料を摂氏37度、5〜10%CO2インキュベーターに入れます。線維芽細胞は、約7日で組織の端からゆっくりと成長し始めます。

これは、約3〜4週間後にはより目立つようになります。また、十分な線維芽細胞が成長している場合は、細胞がプールを分離した後、各ウェルに750マイクロリットルのトリプシンを追加し、線維芽細胞を含浸させた器官型ゲル用のT25組織培養フラスコに移します。まず、サプリメントを添加したdmm中のゲルあたり500,000個の細胞を含む線維芽細胞懸濁液を調製します。

氷上の器官型ゲルを、テキストプロトコールに見られる比率で、ゲル1個あたり1ミリリットルで9個のゲルを作ります。10ミリリットルを準備し、泡を避けるために穏やかに混ぜます。次に、24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルを加え、加湿雰囲気下で摂氏37度で1時間インキュベートします。

1時間後にゲルを固めるには、ゲルの上に1ミリリットルのサプリメントDM EMを加え、インキュベーターに一晩戻します。翌日。ゲルの上から培地を吸引し、ゲルコーティングナイロンシート用の500, 000結腸直腸癌上皮細胞を含む培地1ミリリットルをプレート

滅菌鉗子を使用して、事前に1.5センチメートル×1.5センチメートルの滅菌オートクレーブナイロンシートを準備します。必要な数のナイロンシートを10センチの培養皿に入れます。テキストプロトコルに記載されているように、氷上でゲル混合物を調製し、溶液が中和されたことを示すピンク色に変わるまで、0.1モルの水酸化ナトリウムをゲル混合物に加えます。

次に、この溶液を各ナイロンシートに250マイクロリットル加えます。次に、5%CO2の加湿雰囲気で摂氏37度で30分間インキュベートし、ゲルを硬化させます。次に、PBS中の10ミリリットルの1%グルタルアルデヒド溶液を各10cm培養皿に加えます。

ゲルが固まったら、摂氏4度で1時間インキュベートする前に、ナイロンシートをPBSで3回、サプリメントdmeで1回洗います。シートを摂氏4度の同じ緩衝液で一晩インキュベートし、有機型ゲルを鋼鉄格子上に昇降させ、ステンレス鋼板を三脚状に折りたたんで調製した侵入滅菌足場グリッドに浮上させます。次に、滅菌した鉗子とエタノールを使用して、6ウェルプレートの各ウェルにスチールグリッドを配置します。

コラーゲン面を上にしてジェルコーティングしたナイロンシートを各グリッドに置きます。器官型ゲルを24ウェルプレートから隆起したナイロンシートに、スパチュラを使用して慎重に移し、滅菌し、エタノールします。ナイロンシートが培地と接触しているが水没していないまで、ウェルにサプリメントのDmemを充填します。

培地が器官型ゲルに触れないようにしてください。5%CO2の加湿雰囲気下で摂氏37度で14日間インキュベートします。培地は2日ごとに交換します。

ナイロンシートを含む器官型全体をウェルから取り出し、しがみつくフィルムの上に置きます。清潔な使い捨てメスを使用して器官型シートとナイロンシートを二等分し、両方の半分をホルムアルデヒドで24時間固定します。室温で、24時間後にホルムアルデヒドを70%エタノールに交換し、一晩放置してからパラフィンに包埋し、切片化し、レーザーマイクロダイセクションを実施します。

最初のセクションは、膜に取り付けられたスライドに10ミクロンの厚さの器官型です。テキストプロトコルに記載されているように切片を処理した後、選択したプラットフォームフォームを使用してレーザーマイクロダイセクトを実施する準備をします。スライドガラスをステンド部分にマイクロ解剖して置きます。

顕微鏡ステージに伏せて、0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブをコレクションカセットに取り付け、キャップに50マイクロリットルの細胞溶解バッファーを追加します。ジョイスティックを使用して目的の組織を特定し、ソフトウェアインターフェースを使用して、染色された有機切片に注釈を付け、腫瘍浸潤フロントでマイクロディスクトする細胞を強調表示します。レーザーに発射を指示すると、強調表示された部分が切り取られ、マイクロディスクト組織がマイクロ遠心チューブのキャップに推進されます。

適切な方法でサンプルを処理し、目的の分析物を抽出します。器官型間質に浸潤するSW480結腸直腸癌細胞のレーザーマイクロダイセクション画像をここに示します。クレスタルバイオレットは、結腸直腸癌上皮細胞を強調するために使用されます。

その後、浸潤性腫瘍島は、レーザー解剖が行われ、切断片が収集装置に輸送される前に定義されます。非浸潤細胞と間質細胞は、同じ方法を使用して同定および単離されます。3次元共培養物をマイクロRNAプロファイリングによって分析し、浸潤性腫瘍前面の細胞と層状腫瘍ゾーンの細胞間で発現差のあるマイクロRNAを比較しました。

データは、完全な変更とデータ値のプラスまたはマイナスの 2 倍でソートされました。代表的な実験からの変化を示し、浸潤性マージン細胞と非侵襲性マージン細胞との間のマイクロRNA遺伝子発現の違いを示す。このビデオを見れば、解剖学的に適切な器官型モデルを構築する方法と、レーザーマイクロダイセクションを使用して細胞の個々の集団を分離し、さらなる研究を行う方法について理解できるはずです。おっと。