リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

Mass squirmプロトコルは、アイソトピックメチル化およびMALDI質量分析を用いてリシン脱メチル化酵素活性を定量することを目的としています。まず、メチル化リシンを含むペプチドを用いて、酵素触媒による脱メチル化反応を行います。次に、脱メチル化反応のペプチド生成物を重水素化ホルムアルデヒドで化学的にメチル化し、MALDIで同様にイオン化される一様にメチル化されたペプチドを生成します。続いて、MALDI質量分析により各ペプチド種を定量し、同位体の重複を考慮します。非メチル化、モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化ペプチドの相対量を特定するために、mass squirmの結果から、質量の変化に基づいて各脱メチル化反応生成物の相対量を決定します。

ルーチン的なショットガン質量分析などの既存手法に対するこの手法の主な利点は、マススコアによって、メチル化の状態が異なるペプチド間のイオン化効率の差を考慮できることです。我々がこのアプローチを着想したのは、同位体標識した無水酢酸を用いてヒストンアセチル化レベルを測定する方法を開発した時でした。この手法における課題はピーク面積データの抽出であり、ペプチドの同位体エンベロープの重複によって複雑になる場合があります。

脱メチル化反応のため、125 nanogramsの組換えリシン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）と0.25 microgramsのビオチン化ジメチルヒストンH3ペプチドを、最終容量20 microlitersの脱メチル化バッファー中で混合した。また、LSD1酵素を含まず0.25 microgramsのペプチドを含むコントロール試料も調製した。反応チューブとコントロールチューブを37 degrees Celsiusで2時間インキュベートした。次に、R2 20 micron多孔質ビーズを調製するため、ビーズとメタノールを等量ずつ混合した。

次に、10倍量のTFAギ酸を加え、各サンプルに多孔質ビーズを8 µL添加し、室温で15分間攪拌します。その間に、2本のC18 ZipTipをコンディショニングします。0.1%TFAで20 µLずつ2回ピペッティングし、続いて70%アセトニトリル含有0.1%TFAで4回、最後に再び0.1%TFAで4回ピペッティングします。

次に、コンディショニング済みのZipTipに2つのサンプルをロードします。ピペッターを用いて、C 18樹脂に液量を押し通します。両サンプルの全量がZipTipを通過するまで、この操作を繰り返します。

次に、zip tipを0.1% TFAで2回洗浄し、40 µLの溶出バッファーでサンプルを溶出させます。その後、スピードバック濃縮機を用いて完全に乾燥させます。まず、サンプルを100 µLの50 mM リン酸バッファー（pH 7.4）に再懸濁します。続いて、8 µLのボアジメチルアミンと16 µLの希釈ホルムアルデヒドを加えます。

4 °Cで2時間インキュベートします。ホウ素ジメチルアミンと重水素化ホルムアルデヒドを添加して還元メチル化を繰り返し、2時間インキュベートします。3回目は、ホウ素ジメチルアミンを添加し、4 °Cで15時間インキュベートします。

1 M Tris (pH 7.4)を12.5 µL加え、反応を停止させます。スピードバック濃縮機を用いて完全に乾燥させます。次に、コントロールおよび脱メチル化酵素反応サンプルを、50 mM リン酸緩衝液 (pH 7.4) 100 µLで再懸濁します。

次に、コントロールおよび脱メチル化酵素反応サンプルに 8 µL の多孔質ビーズを加え、前述のように ZipTip で回収します。2 µL ずつ MALDI サンプルプレートに溶出し、室温で結晶化するまで乾燥させます。その後、質量分析によりサンプルを分析します。

分光ファイルのデータを解析ソフトウェアで開き、M over Z ソフトウェアにエクスポートします。さらに、タンデム質量分析により反応生成物を検証します。まず、コントロール試料について、モノアイソトピックピークに対する炭素13 C2および炭素13 C4同位体のピーク面積比を決定します。

これらの算出された比率を用いて、各修飾に存在するペプチドの相対量を定量します。脱メチル化反応サンプルの状態を示します。LSDの一種類の酵素は、リシン脱メチル化の質量分析による定量に効果的に使用できます。

対照反応では還元メチル化が起こらないため、このペプチドの典型的な同位体エンベロープが示されます。得られたピーク面積から、$^{13}\text{C}_2$および$^{13}\text{C}_4$として存在するペプチドのバックグラウンド比が決定されます。対照反応のマススペクトルから得られる同位体状態およびピーク面積により、各修飾状態で存在するペプチドの相対量を定量することができます。脱メチル化反応において、これら対照反応と脱メチル化反応のピーク面積から、33.7%のジメチルリシン4、420.3%のモノメチルリシン4、および24%の非メチル化リシン4であることが決定されました。

この質量分析を用いたアプローチは、ヒストンリジン残基の脱メチル化がさまざまな疾患にどのように寄与しているかなど、ヒストンのエピジェネティクス分野における重要な知見を提供します。このメチル化アッセイは脱メチル化酵素の研究に適用されてきましたが、メチルトランスフェラーゼの研究にも利用可能です。