病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

本実験の全体的な目的は、修復されると蛍光を発する分子ビーコンを用いて、DNA修復速度および細胞核抽出液をリアルタイムで測定することです。塩基切除修復用分子ビーコンは、単一の塩基病変を含むステムループ構造のデオキシオリゴヌクレオチドで構成されており、折りたたまれた際に5'末端に6-FAM（フルオレセイン）部位が、3'末端にDabcyl部位が結合しています。6-FAM部位は、フェルスター共鳴エネルギー転移（FRET）によりDabcylで消光され、非蛍光状態となります。

DNA修復活性を評価するため、修復酵素を含む細胞核抽出液とビーコンをインキュベートします。DNAグリコシラーゼがビーコン内のDNA病変を認識して除去します。これにより生じたABA部位は、APエンドヌクレアーゼ1（APE1）の基質となります。APE1が認識すると、ABA部位でDNA主鎖を切断し、6-FAMを含むDNAがヘアピンから自由に解離できるようになります。

クエンチャーからの分離によって蛍光が増加し、それはDNA修復レベルに比例するため、定量リアルタイムPCR装置を用いてリアルタイムで評価することが可能です。DNA損傷を修復する能力は、あらゆる細胞および生物にとって極めて重要です。数ある細胞内DNA修復経路の中で、塩基除去修復は、酸化ストレスや化学的な侵害によって生じた損傷塩基を標的としています。塩基除去修復に影響を及ぼし得る個々の細胞構成要素の役割を明らかにすることが、当研究室における研究の主な目的の一つです。

そのため、DNA修復活性を正確かつ感度良く測定することが、当研究室の関心事となっています。本アッセイによって、そのようなデータの取得が可能です。³²P標識およびゲル電気泳動による解析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、放射性標識基質を使用せず、DNA修復速度をリアルタイムで測定でき、かつダイナミックレンジが非常に広いことです。

さらに、この手法では、さまざまな異なる蛍光色素や塩基損傷を利用して基質特異性を決定させることができます。我々は、このアッセイがさまざまな条件下で非常に定量的かつ高感度であることを示しました。この塩基除去修復分子ビーコンアッセイは、速度論的解析に適しています。

本アッセイの高い感度と特異性により、塩基除去修復の正確な定量が可能であり、したがって修復阻害剤のスクリーニングやバリデーションに有用です。さらに、DNA修復活性の測定や、機能的バイオマーカー測定のための組織および腫瘍細胞溶解液への適用も可能です。本アッセイに使用する分子ビーコンを設計する際は、ここに示す43塩基長の以下のDNAオリゴヌクレオチドを検討してください。

適切に機能させます。DNA配列は一意的である必要はありませんが、ヘアピン構造を形成できる必要があります。ここに示すように折りたたまれた際、ウラシルやテトラヒドロフランなどの特異的な塩基損傷を挿入することで、特異性が得られます。

5'末端から6塩基目のX位置において、GC含量は少なくとも32%である必要があり、5'末端にGB塩基を配置してはいけません。5'末端には6-カルボキシフルオレセインまたは6-FAMを結合させ、3'末端はdab silで修飾する必要があります。これにより、DNA修復タンパク質の基質となり、グリコシル基放出の結合と活性を担保します。

病変部位の位置は、ヘアピン構造およびDNA末端から十分な距離を確保するように選択されています。ステムまたはヘアピン二本鎖の長さは、最低15塩基対である必要があります。推奨されるループの長さは13塩基です。

コントロール用の分子ビーコンは、DNA損傷を含まない点を除いて、実験用分子ビーコンと同一である必要があります。したがって、DNA修復酵素によって認識されることはありません。分子ビーコンを入手したら、加熱するまでビーコンが蛍光を発しないことを確認するために、品質評価を行う必要があります。

最適な融解温度を決定するため、抽出手順のすべてのステップは氷上または4 °Cで実施してください。タンパク質の安定性を確保するため、事前に冷却して実験の準備を整えます。サンプルあたりの1 Lビーカー2個、透析緩衝液、透析室、マイクロ遠心チューブ、シリンジ、および針を用意してください。

15 mLのコニカルチューブにラベルを貼り、氷上に置きます。細胞から培地を吸引して除去し、冷PBS 7.5 mLで2回洗浄します。2回目の洗浄後、各ディッシュに冷PBS 5 mLを加え、セルリフターを用いてプレートから細胞を回収します。

細胞を冷却した15 mLコニカルチューブに移し、4°Cで500 ×gにて5分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、同様のチューブ内の既知の液量と比較してパッキング細胞容積を推定します。さらに1分間遠心分離し、残ったPBSをピペットで吸い取って除去します。

細胞ペレットを、濃縮細胞容積50 µLあたり150 µLのnuke buster抽出試薬1に懸濁させます。次に、再懸濁した細胞をあらかじめ冷却した1.5 mLチューブに移し、高速で15秒間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブを氷上で5分間インキュベートし、さらに15秒間ボルテックスした後、4 °Cで13,000 ×gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、細胞質画分を含む上清を除去して廃棄します。パッキングされた細胞量 50 µL あたり、100 x プロテアーゼ阻害剤カクテル 1 µL、100 mM DTT 1 µL、および Nuke Buster 抽出試薬2 75 µL の混合液を用いて、ペレットを再懸濁します。

細胞を高速で15秒間ボルテックスします。氷上で5分間インキュベートした後、再度高速で15秒間ボルテックスし、4°Cで13,000 ×gにて5分間遠心分離します。遠心後、核タンパク質を含む上清をシリンジで回収し、分画分子量7,000のスライドダイアリシスカセットに移します。

次に、あらかじめ冷却したダイアリシスバッファー 500 mL に 1 M DTT を 500 µL 加え、溶解物を 4 °C で緩やかに撹拌しながら 90 分間透析します。90 分後、透析カセットを、DTTを含むあらかじめ冷却したダイアリシスバッファー 0.5 L が入った2つ目のビーカーに移し、さらに透析します。溶解物を 4 °C で緩やかに撹拌しながら 90 分間透析した後、タンパク質濃度が高いため、抽出液が結晶化している場合があります。

次に、カセットの注入に使用したものとは別のポートに新しいシリンジを挿入し、透析カセットから透析後の核タンパク質溶液を回収します。核タンパク質溶液を回収する際は、白濁した結晶が含まれるようにしてください。サンプルを20 µLずつマイクロ遠心チューブに分注し、ドライアイスで急速冷凍した後、使用まで-80 °Cで保存します。

付属文書に従って、タンパク質濃度を測定し、品質管理を行う。分子ビーコンアッセイを行うには、細胞溶解物を解凍し、1 mMのDTTを含む基本塩基除去修復反応バッファーを用いて、タンパク質濃度が2 µg/µLになるように希釈する。分子ビーコンを基本塩基除去修復反応バッファーを用いて200 µMに希釈する。定量リアルタイムPCR機は通常フルオリメーターとして使用されないため、37 °Cで少なくとも180サイクル、20秒ごとにデータを収集するように、定量リアルタイムPCR機のランメソッドを変更する。

その後、ノーマライゼーション用のデータを取得するため、分子ビーコンの最大蛍光条件下で20秒ごとに15サイクル行います。反応液量を25 µLに設定します。次に、Applied Biosystemsソフトウェアを用いて装置上のプレートデザインを設定し、実験タイプとして標準曲線を選択してプレートレイアウトを完了させます。

例をこの表に示します。この表は付属文書でも確認できます。標準曲線として選択したウェルには何も添加しないでください。塩基除去修復反応緩衝液、DTT、2 µg/µLの濃度の細胞溶解液、および実験に使用するすべての分子ビーコンを氷上に準備します。

次に、DTTを塩基除去修復反応バッファーに加え、最終濃度を1 mMにします。DTTを含む塩基除去修復反応バッファー15 µLを、氷上の互換性のある光学用QRTPCRプレートの各ウェルにピペットで分注します。続いて、プレートレイアウトに従って、ビーコンを適切なウェルにピペットで分注します。

溶解物と分子ビーコンまたはコントロールの各組み合わせについて、3連（triplicate）でアッセイしてください。最後に、希釈した核溶解物を各ウェルに 5 µL ずつ分注します。すべての分子ビーコン試薬を冷やしたまま保持すること、および溶解物のプレートへの分注を最終ステップとして行うことが重要です。

ライセートには活性タンパク質が含まれており、反応混合液にピペッティングした直後から分子ビーコンの修復が始まります。したがって、測定を開始する前に起こるビーコンの修復量を最小限に抑えるため、すべての試薬を低温に保つことが非常に重要です。すべての試薬を添加した後、プレートを光学用密閉フィルムで封印し、プレートを軽くタッピングして混合してください。

次に、遠心分離機で10秒間の短時間遠心を行い、チューブまたはプレートの底に溶液を集めます。遠心後、プレートを定量リアルタイムPCR機にセットし、アッセイを開始します。完了後、未処理データを（できればExcel形式で）エクスポートし、必要な計算を行った後、添付ドキュメントの指示に従ってデータを解析します。DNA修復活性および LN 4 28 細胞および LN 4 28 MPG と指定された MPG 過剰発現細胞株からの核抽出物の品質を評価するため、標準化された蛍光データを、y軸に free FAM の割合（%）、x軸に時間（秒）として、対応する誤差棒を含む散布図にプロットします。このビデオで説明したアッセイは、ポジティブコントロールとして APE 1 基質 tetra furin を含む分子ビーコンを用いて実施されました。

この図に示されているように、急峻な勾配で示されるAPE1活性と、MPG基質の除去に特異的なDNAグリコシラーゼ活性の両方が、2つの細胞株で強固に認められます。HXとして示されるヒポキサンチンを、両細胞株の核ライセートから測定しました。各ライセートは、塩基除去修復コントロール用分子ビーコン、または塩基除去修復HX用分子ビーコンを用いて分析しました。コントロールビーコンのLN 4 28は緑色で、ヒポビーコンのLN 4 28 MPGは紫色で示されています。

LN 4 28を青色、LN 4 28 MPGをオレンジ色で示しています。結果は、Aに平均蛍光ユニット、Bに正規化蛍光として報告しています。各細胞において、HX修復を示す蛍光の時間依存的な増加が認められました。

ライセートをHX分子ビーコンとともにインキュベートした結果、予想通りの結果が得られた。オレンジ色のトレースで示されるLN 4 28 MPG細胞株は、親株であるLN 4 28細胞株（MPGタンパク質が最小限である）よりも蛍光の蓄積が速く、修復速度が大幅に高いことが示された。したがって、特定の修復タンパク質による特定のDNA病変の修復速度を、非特異的なDNA切断によるバックグラウンドレベルを最小限に抑えながら、細胞抽出物を用いてリアルタイムで測定することが可能である。

このビデオを視聴することで、分子ビーコンの設計方法と、精製タンパク質または細胞溶解物を用いたリアルタイムDNA修復速度の測定方法について、十分に理解することができます。解析に関しては、ダイナミックレンジとバックグラウンド値を評価することが不可欠であり、そのためには陽性および陰性コントロールビーコンを用いた対照反応などのコントロールを組み込んでください。ウェル間のばらつきを考慮し、個々のウェルのデータを入力値で標準化することが有用です。

これらは融解温度のより微細なステップによって決定されます。これに加え、ロックダイのような他の染料を導入することで、ピペッティング誤差や検出器間の差異に起因する固有の変動を考慮することが可能になります。この手法により、個々の塩基除去修復コンポーネントが全体的な修復活性および能力に及ぼす影響を明らかにすることができました。

本手法は十分に高感度であるため、従来の手法では検出できなかった微小な変化を明らかにすることが可能です。