脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

本手順では、脾臓を通過する寄生虫のダイナミクスを評価するための定量的生体内顕微鏡アプローチについて解説します。げっ歯類マラリアモデルにおいて、GFP導入トランスジェニック寄生虫に感染させたマウスを準備し、脾臓の生体内顕微鏡観察を行います。脾静脈へのカニュレーションにより、生体内染色の注入が可能になります。実験中、脾臓のさまざまな領域を移動する蛍光細胞をイメージングします。

赤脾髄の三次元的な緩徐区画における寄生虫の移動性を記述する理論モデルを提供し、血管の血流を算出します。これらのパラメータを用いて、2つのPULE系統における脾臓のダイナミクスを比較しました。皆さん、こんにちは。

私の名前はNando El Portilloです。私の研究室における主要な研究課題の一つは、マラリアにおける脾臓の役割を解明することです。脾腫はこの疾患の顕著な特徴の一つですが、技術的および倫理的な問題があるため、この器官の研究に取り組むことは非常に困難です。そこで私たちは、寄生虫の動的な通過を観察し、この現象を定量化することを可能にする技術を導入しました。

これがLorenaとMIがこれらのプロトコルで説明する内容です。この研究は、ドイツのハンブルク大学のDr.LerのグループおよびここHospital ClinicのDr.Maria Kboのグループとの共同研究として一部実施されており、found fion Cellexおよびministerial CIAからの一般助成を受けています。感染は、致死性または非致死性のGFP寄生虫を10%の寄生率でドナーMに感染させることで開始します。寄生虫を確認するには、マウスの尾静脈から少量の血液を採取し、顕微鏡標本として展延させます。

GIMsを用いた染色用スライドを作成します。溶液を用いることで、乾燥後に感染した赤血球を可視化できます。血液塗抹標本をMethanolで2分間固定し、GIMs溶液を滴下して20分間インキュベートします。スライドを水道水で洗浄して乾燥させ、100倍油浸対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、全赤血球に対する感染赤血球（pbcs）の割合を算出します。

ドナーマウスの尾静脈血から得た致死性または非致死性の寄生虫をPBSで希釈し、マウスに感染させます。感染後3日目に末梢血寄生率が1%に達するように、マウス1匹あたり50万個の寄生虫を腹腔内に注入して投与量を調整します。あるいは、コントロールとしてFITC標識赤血球を使用することも可能です。

マウスから1 mLの動脈血を採取し、EDTA含有PBSで遠心分離してペレットを洗浄する。その後、FITC溶液で再懸濁し、穏やかに攪拌しながら暗所で2時間インキュベートする。その後、遠心分離によって上清を除去し、十分に洗浄する。これをコントロールマウスに注入して末梢血中の平均濃度を1%にし、in vivo実験に進む。

こんにちは、mijaです。生体内で脾臓をイメージングするには、脾臓を露出させるために動物に小さな外科的処置を行う必要があります。この手法は、Worker Heisler研究室のStephanie GRから学びました。彼女に感謝するとともに、ここからはその手順について説明します。

感染マウスのイメージングは、両系統ともにパラサイト率が1%となる感染後3日目に実施しました。処置中はマウスを麻酔状態で維持し、温度を管理してください。眼を乾燥から保護し、物質の静脈内投与を容易にするため、処置を開始する前に足底を刺激してマウスが完全に麻酔状態にあることを確認してください。

実験の過程で、マウスの尾静脈にカニューレを留置し、カニューレを構築します。チューブの一端に小さな針を挿入し、もう一端にアプリケーターを装着します。気泡を取り除きながら生理食塩水でカニューレを満たし、溶液がカニューレ内を正しく流れることを確認してください。

尾の側静脈をカニュレーションします。尾の付け根を軽く絞めて、静脈の視認性を高めます。カニューレの先端を静脈内に挿入します。

血液が現れれば、針が適切に配置されたことを示します。適切でない場合は、静脈の上流でカニュレーションをやり直し、その後、接着剤とテープを用いてカニューレを尾に固定します。動物の左背側の皮膚と筋肉を小さく切開し、脾臓の下部を露出させます。

呼吸による動きが少ない位置に脾臓を配置し、表面にPBSを塗布してマウスの毛を取り除き、湿潤状態を維持します。可視化させるため、カバースリップで脾臓を密封します。こんにちは、Lorenaです。

本プロトコルでは、GFP導入遺伝子を持つ寄生虫を用いることで、脾臓内におけるPULI寄生虫の移動を可視化します。なお、この寄生虫はドレクセル大学のJames Burnes氏より提供されたものです。

蛍光標識された寄生虫の移動をイメージングすることで、致死性株と非致死性株の間で行動に違いがあるかを確認することができます。生体顕微鏡実験は、温度制御機能付きインキュベーションシステムと63倍グリセロール浸液対物レンズを備えたLeicaマルチフォートン顕微鏡を用いて行いました。動物を顕微鏡のステージ上に置き、カバーガラスを介して脾臓を対物レンズ側に向けて配置します。まず最初に。

低倍率で脾臓を可視化することで、この器官の微小循環構造の全体像を把握することができます。自己蛍光組織を用いて脾臓にピントを合わせると、GFP発現寄生虫が脾臓のさまざまな領域を通過して移動する様子が観察されます。こんにちは。バルセロナ大学の科学技術センターのMaria Alboです。ここでは、脾臓の生体内イメージングを行います。

感染した赤血球の血流と可動性を研究するため、共焦点顕微鏡を使用します。この顕微鏡にはレゾナントスキャナーが搭載されており、臓器の動きによる影響を回避するために非常に有用な高速イメージングが可能です。また、これは視覚範囲を選択できるスペクトル顕微鏡です。超高速でイメージングを行うため、2種類のフルオレセイン標識と反射光を同時に取得します。

RBC、反射、コントラスト、およびVidal染色の助けを借りて、脾臓の微小血管を可視化するための異なる領域を選択します。ここでは、Vidal顕微鏡とImageJソフトウェアを用いて、赤脾髄の三次元網状構造における寄生虫の動きを追跡し、血管血流内での寄生虫の可動性を測定する方法について説明します。高速スキャニングモードを使用して、5つのZ深さで画像を取得してください。

単一の蛍光細胞のトラッキングを容易にするため、画像スタックをZコード化されたカラームービーに変換します。詳細な情報はテキストに記載されています。X、Y、Z、およびT座標を用いて、各ビデオの奥行きにおける異なる粒子の経時的な追跡を行います。方向性、平均速度、滞在時間などの移動パラメータを計算し、分布マップとして的に表示することで、菌株集団間の比較分析が可能になります。デキストリンなど、サポートテーブルに記載されているいくつかの蛍光分子を全身投与することで、脾臓内の血管流をイメージングできます。

そして、内因性赤血球の反射コントラストを用い、血管をレーザースキャンの方向と水平に配置し、強化ライン平均処理（enhanced Line average）を適用して、中心線血流をスキャンします。これらの画像において、移動する細胞によって生じるストリークを用いて血流を算出します。変動を補正するため、異なる直径の血管および心周期全体にわたる血管の画像を撮影します。脾臓は長らくマラリア研究におけるブラックボックスと考えられてきましたが、本研究では、この臓器における寄生虫感染と血流のダイナミクスに関する知見を得るための定量的な生体内顕微鏡アプローチを開発し、感染赤血球の脾臓へのin vivoでの粘着性などの重要な生物学的課題に取り組むことを可能にしました。

ありがとうございました。