ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

本手順の総合的な目的は、Human Protein Atlasのようなハイスループットプロジェクトにおいて、複数の組織からタンパク質発現に関する情報を同時に取得するための効率的な手法を用いることです。これは、まずホルマリン固定パラフィン包埋組織の代表的な領域を選択し、次にマークした領域をパンチで抜き取り、選択したコアを単一のパラフィンブロック（組織マイクロアレイ）に組み立てることで達成されます。

次に、TMAから切片を作成し、免疫組織化学染色を行います。最後に、タンパク質の発現パターンを解析し、そのデータをHuman Protein Atlasで公開します。最終的に、組織マイクロアレイと免疫組織化学染色を通じて、組織および細胞におけるタンパク質発現を示す結果を得ることができます。

単一の組織親ブロックから免疫組織化学染色を行うなどの既存の手法と比較して、この手法の主な利点は、貴重な生体試料を節約でき、実験の再現性が高まることです。また、この手法のもう一つの利点は、ENT費用だけでなく、研究室での処理時間も削減できることです。組織コアの標準的な長さを取得するためのこの手順については、私の研究室のラボテクニシャンであるIan call Bayが実演します。

スタイレットに印を付けます。適切なパンチを装着させる際、パラフィンが割れるのを防ぐため、パラフィンブロックの両側に2.5〜3.0 mmの余白を設けることを推奨します。パンチを固定している六角穴付きボルトを緩め、パンチハブの溝がプラスチック製Vブロック内の金属ロッドにしっかりと密着するようにパンチを配置します。

メタルクリップの端が水平であることを確認しながら、ネジを締めます。左側にレシピエントパンチを、右側にドナーパンチを挿入します。XY調整ノブとデジタルマイクロメーターの読み取り値を使用して、パンチをX軸およびY軸方向に移動させます。

装置をリセットするには、zero a BSボタンを押してインチとミリメートルの切り替えを行い、inch millimeterボタンを押してください。9×8のテンプレートに1 mmのパンチを使用する場合、受容パンチを押し込みすぎてパンチを損傷させるのを防ぐため、穴の中心間で測定した穴の間隔は2 mmにする必要があります。パンチの押し込み最大深さを設定するには、ホルダーに空のカセットを挿入し、Zガイドの左上隅にある深さストップネジを使用して、受容パンチの下端の位置をカセットの底から1 mm上に設定します。組織切片上の該当領域を選択してマーキングし、組織マイクロアレイ作製用のテンプレートを設計した後、受容ブロックをホルダーに入れ、最小サイズのドライバーでネジを固定します。

パラフィンがカセットから脱落するのを防ぐため、ネジを締めすぎないようにしてください。レシピエントパンチをレシピエントブロックに約5 mm押し込み、パンチのハンドルを使用してパンチを前後に回転させます。その後、押し込んでいた圧力をゆっくりと緩め、スプリングによってパンチが上昇するようにします。

スタイルを用いてパンチ内を空にし、パラフィンコアを廃棄します。次に、タレットを移動してドナーパンチに切り替えます。その後、レシピエントブロックホルダーの上に、ドナーブロックを載せたドナーブロックブリッジを配置します。

関心領域がマークされた対応するヘマトキシリン・エオジン染色スライドを用いて、サンプリングする組織の位置を確認します。左手でドナーブロックを固定し、右手でパンチを押し込みます。スタイレット部分は押さないでください。デプスストッパーはドナーブロックに対して適切な位置でパンチの動きを停止させないため、スタイレットの2番目のマークが見えた時点で押し込みを止めることが重要です。

パンチのハンドルをゆっくりと1回回転させます。ドナーブロックをドナーブロックブリッジに保持したまま、下方への圧力を解除します。ブリッジとドナーブロックを取り除きます。

ドナーパンチが、先に作成した穴と一致していることを確認してください。セットスクリューを使用してパンチの位置を調整します。ドナーパンチとレシピエントブロックの穴が一致していない場合は、パンチの先端がレシピエントブロックの穴の上端に達するまで、慎重にパンチを下方へ押し下げてください。

この状態を保持しながら、スタイレットを使用して組織コアを穴の中に押し出します。コアの表面がブロックの表面と揃っている必要があります。その後、タレットをレシピエントパンチまで戻します。

XY調整ノブを使用して次の位置に移動し、レシピエントブロックからサンプルをパンチし、アレイが完了するまでこの操作を繰り返します。レシピエントブロックを取り出すには、ホルダーのネジを緩めます。ブロックをガラススライドの上に裏向きに置き、適切なラックに配置して、42 °Cで40分間ベイクします。

オーブンからスライドとブロックを取り出し、ガラススライドで軽く撫でるようにしてブロックの表面を平らにします。ガラススライドを載せたままブロックを冷却プレートの上に10分間置きます。ブロックからガラススライドを取り除きます。

これでブロックが完成し、切片作成が可能な状態になりました。切片を作成した後、目的のタンパク質に対する抗体を用いて組織マイクロアレイの染色およびデジタル化を行います。www.proteinatlas.org のウェブサイトにアクセスし、ヒトプロテインアトラスで目的のタンパク質を検索してください。

目的とするタンパク質のEnsembl ID、UniProtアクセッション番号、またはHGNC名（例：insulin）を入力してください。目的のタンパク質をクリックし、「normal tissue and organ summary（正常組織および器官の概要）」までスクロールします。概要には、膵臓におけるタンパク質の発現が表示されます。

タブをクリックします。「More tissue data」を選択すると、臓器別にソートされた正常組織のビューが表示されます。

膵臓をクリックして、同一のタンパク質に対する3種類の抗体を用いたIHCの結果を確認してください。画像をクリックすると、膵臓の高解像度画像が表示されます。この図では、組織マイクロアレイの品質例が示されており、行と列の間およびパラフィンの端に十分なスペースがあり、直線的に適切に配置されたアレイが示されています。一方、ここでは一部のコアが端に近すぎており、おそらく切片作成時に問題が生じると考えられます。

この組織マイクロアレイは、乾燥時間が長すぎたため、適切なテンプレートなしに崩壊してしまいました。ここでは、列が直線的に揃っており適切に切断された切片を、ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E染色）で染色しています。刃が不適切であったり汚れていたりすると、ここに示すような裂け目や、このような圧縮された切片が生じる可能性があります。

リンパ節の胚中心細胞では、最適に調整された抗体を用いることで、ここに見られるようにバックグラウンドのない特異的な細胞質染色は得られます。一次抗体の濃度が低すぎる場合や、免疫染色した組織に標的タンパク質が存在しない場合は、陰性または弱陽性の染色となります。この組織切片は、一次抗体の濃度が高すぎたために過剰染色されています。

色が濃いと、スピルオーバー、交差反応、および偽陽性が原因で、細胞内局在の判定が困難になります。このビデオを視聴することで、組織マーカーアレイの作製方法と、免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析におけるその使用方法について十分に理解できるはずです。また、ヒト組織および細胞におけるタンパク質発現について、Human Protein Atlasを検索する方法についても十分に理解できるはずです。