ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング

この手順の全体的な目的は、創傷治癒を支援するために幹細胞を輸送し分化させることができる、天然バイオマテリアルからなる複合マトリックスを作成することです。まず、実験動物から脂肪由来幹細胞（ASC）を単離することでこれを達成します。次に、これらのASCをあらかじめ作製したキトサンマイクロスフェアにロードします。

次に、線維化したコラーゲンゲルをキャストし、その上にA-S-C-C-S-Mビーズを積層します。最後に、A-S-C-C-S-Mコラーゲンゲルの上にPEGフィブリンゲルをキャストし、培地を加えます。これにより、CSMビーズからコラーゲンマトリックスとPEGフィブリンマトリックスの両方へ、A SCが双方向に同時に遊走する結果を得ることができます。

この手順により、単一の幹細胞源がコラーゲンおよびPEGフィブリンの微小環境から異なる分化シグナルを受け取り、多面的に刺激されることで多分化能因子を産生し、前血管構造のネットワークを形成することができます。単一材料の複合体や脱細胞化皮膚代替物などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、他の製品では宿主による製品の再血管化に能動的にアプローチしていない点にあります。私たちは、単離したRAD A SEを豚フィブリンマトリックスで培養した際に、血管表現型へと分化する傾向があることに気づいた時に、初めてこの手法を考案しました。

この観察により、単一の幹細胞源を、異なるバイオマテリアルで構成されるシステム内で同時に利用できるという考えが生まれました。脂肪由来幹細胞（ASC）の単離および培養、キトサンマイクロスフェア（CSM）の調製、およびCSMへのASCの封入を行った後、コハク酸グルタレート修飾PEGを4 mLのトリス緩衝生理食塩水に溶解させ、ポリエチレングリコール・フィブリンハイドロゲルを調製します。実験の直前に、0.22 µmフィルターを用いて溶液を滅菌してください。

6ウェルプレートの培養ウェルに、500 µLのフィブリノゲンストック液と250 µLのPEGストック液を混ぜ合わせ、37 °Cの5% CO₂加湿インキュベーターで20分間インキュベートする。次に、あらかじめ調製したA-S-C-C-S-M 250 µLをペグ化フィブリノゲン溶液に混ぜ、直ちにトロンビンストック溶液1 mLを添加し、ピペットを用いて迅速に1〜2回トリチュレーション（吸い上げと吐き出し）を行う。その後、細胞ゲル混合液を直ちに12ウェルプレートに移し、37 °Cの5% CO₂加湿チャンバー内で10分間インキュベートする。続いて、得られたPEGフィブリンをHBSSで2回洗浄し、10% FBSを添加したα-MEMを用い、37 °Cの5% CO₂加湿インキュベーター内で11日間にわたり標準的な光学顕微鏡観察を行いながらインキュベートする。

CSMからゲルミックス内への細胞の遊走を観察します。A-S-C-C-S-Mには、2Nの水酸化ナトリウムを用いてラット尾腱から抽出したI型コラーゲンを使用します。pHを6.8に調整し、フィブリル化させます。フィブリル化したコラーゲンとA-S-C-C-S-Mの混合液を12ウェルプレートに加え、5% CO₂加湿インキュベーターにて37 °Cで30分間インキュベートします。

フィブリル形成が完了したことを確認した後、コラーゲンA-S-C-C-S-Mゲルを37 °C、5% 二酸化炭素加湿インキュベーター内で最大11日間インキュベートします。標準的な顕微鏡観察法を用いて、11日間にわたりCSMからゲルへの細胞の遊走を観察し、2つのバイオスキャフォールドを用いて、単一の幹細胞源の遊走および共誘導特性を研究するための二層構造体を構築します。

コラーゲンおよびPEGフィブリンゲルの両方を、以下のわずかな変更を加えて準備します。まず、7.5 mg/mLのコラーゲンを1 mL調製します。次に、混合物を6ウェル組織培養インサートに移し、37 °Cで30分間インキュベートします。完全に線維化させた後、コラーゲンの表面に、培養培地で希釈した5 mgのASCCSM 200 µLを重層させます。

マイクロスフィアがゲルの上に沈降した後、250 µLの細胞培養液を用いてPEGフィブリンゲルを調製します。次に、ペグ化フィブリノゲン・トロンビン溶液をA-S-C-C-S-Mコラーゲン層の上に重ねます。完了後、構築物を5%二酸化炭素加湿インキュベーター内で30分間インキュベートし、完全に定着させます。

最後に、上部チャンバーのコンストラクト上に1 mLの培地を、下部チャンバーに3 mLの培地を加えます。このスキャフォールド内に埋め込まれたSCの特性評価により、CSMをロードしたSCは、コラーゲン層とPEGフィブリン層の間に挟み込まれることができ、両方の細胞外環境から同時に、かつ異なるキューを受け取って、新しい条件下で生存できることが明らかになりました。ここで示されているように、コラーゲンはASCsが幹細胞として維持される能力を支持しており、それは緑色で示されたstro-1の発現および線維芽細胞様の形態によって実証されています。

対照的に、PEGフィブリンはASCを無血管表現型へと分化させました。これは、ここに示されている管状の形態（ルーメンを伴う）や、赤色で示されている内皮細胞特異的なvon Willebrand因子（von Willow brandand factor）の発現によって証明されています。さらに、ここで示されているように、これらの観察された表現型は培養の早期に現れ、11日間にわたって維持されました。このビデオを視聴することで、ラット脂肪由来幹細胞の分離方法、キトサンマイクロスフィアへの負荷方法、およびFDA承認済みのバイオマテリアルを用いた二層ハイドロゲルへの組み込み方法について十分な理解が得られるはずです。

本プロトコルで使用されるバイオマテリアルおよび細胞は動物およびヒト由来であり、宿主由来の病原体に汚染されている場合は極めて危険であることに留意してください。したがって、これらの手順を実施する際は、個人用保護具の着用や無菌的な細胞培養操作などの予防策を常に講じる必要があります。