タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

この手順の全体的な目的は、タンデム親和性精製（Tandem affinity purification）として知られる手法を用いて、タンパク質の結合パートナーを単離することです。こんにちは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのウイルス学部門のdLAN Baileyです。私たちの研究室では、ウイルス科のさまざまなウイルスにおけるウイルスと宿主の相互作用について研究しています。

他の細胞タンパク質やウイルスタンパク質と相互作用するタンパク質を特定することは、感染中のウイルスと宿主の相互作用を研究するための優れた出発点となります。このビデオでは、私たちの研究室で採用しているアプローチの一つである、タンデム親和性精製（TAPタグ法）について説明します。本研究で使用したTAPタグは、2つのプロテインGユニットとストレプトアビジン結合ペプチドからなるN末端タグです。

これらはTEVプロテアーゼ切断配列によって隔てられており、これによりベイトタンパク質の特異的な溶出が可能になります。この例では、マウスのEIF4Eがこの融合構築物のC末端に位置しています。TAPタグ付けプロトコルは、6つのステップからなる手順です。

トランスフェクションおよび細胞株の構築後、細胞を誘導してタグ付きベイトタンパク質を発現させ、その後、穏やかな溶解バッファー中で溶解させます。ベイトおよび潜在的な相互作用パートナーを精製し、細胞株を構築するために、2段階のアフィニティー精製と2種類の特異的溶液を用います。HEK 293細胞に、コード配列を含むpMET4発現ベクターをトランスフェクションさせる必要があります。

次に、TAPタグ付きベイトタンパク質発現細胞を100 µg/mLのハイグロマイシンBで選択します。プラスミドはエピソームとして維持されるため、特定のクローンの単離は不要です。コンフルエントに達した10本の細胞フラスコを10 µMの塩化カドミウムで16時間処理して誘導し、その後、細胞を掻き取って培地中に回収します。懸濁した細胞を15 mLチューブに移し、遠心分離によって細胞ペレットを作成します。

その後、これらの細胞を氷冷したPBSで3回洗浄し、最後に遠心分離してペレット化します。ステップ2の細胞溶解では、冷たい溶解バッファー5 mLを加え、ピペッティングを繰り返して細胞を溶解させ、その後5分間氷上に放置します。効率的に溶解させるため、さらに細胞を細いゲージの鈍針でシリンジ通過させ、凍結融解を行います。

得られた上清を1.5 mLチューブに分注し、遠心分離によって未溶解細胞およびデブリを除去します。なお、この遠心分離ステップの後、ペレットのサイズは著しく減少します。次に、ライセートの上清を15 mL Falconチューブに回収し、0.45 µmフィルターに通して、さらに残っているデブリを除去します。

この溶解液から 50 µL の分注液を採取し、以降の分析に使用します。このサンプルをサンプル1と呼びます。ステップ3、rabbit IgG Aerosへの結合。

プロトコルのこの段階では、ウサギIgG Arosを用いてプロテインGタグを免疫沈降させます。Arosビーズを分注する際は、チップの先端をカットしてください。これにより、ビーズへの損傷を防ぐことができます。

ボトルの容器を回して、rabbit IgG aro溶液を穏やかに再懸濁させた後、aroを15 mLチューブに移します。冷却した溶解バッファーを用いてaroを3回洗浄し、各ステップで低速遠心分離を行い、ビーズを洗浄します。遠心分離後、ペレット状になったrabbit IgGビーズが確認できるはずです。

各ステップの後、ビーズを乱さないように注意してバッファーを除去します。最終洗浄が完了したら、ろ過および清澄化を行ったライセートを充填したビーズに加え、3時間または一晩インキュベートします。回転ミキサーを用いて4°Cで処理することが推奨されます。

免疫沈降後、アガロースビーズを遠心分離し、後の解析に用いるため上清を除去します。必要に応じて、細いチップを使用してチューブ内に残った液体を除去してください。この上清が、「サンプル2 ステップ4 TEVプロテアーゼ切断」に使用される試料となります。

このステップでは、ベイトをプロテインGタグから切り出します。この手順により、ベイトタンパク質の特異的な切断が可能となり、ウサギIgGを用いた免疫沈降からの溶出ステップとして機能します。TEV切断ミックスを調製し、先端を取り除いたチップを用いてこれをアガロースビーズに加えます。この混合物をシリコン処理したマイクロ遠心チューブに移し、転倒混和してアガロースを懸濁させた後、4°Cで一晩インキュベートします。分析用に、このTEV切断反応液の一部を分注して回収します。

これはサンプル3です。ローテーティングミキサーで一晩インキュベートすることで、TEV反応をほぼ完了させることができます。ステップ5、ストレプトアビジンビーズへの結合による固定化です。

このステップでは、Cleveベイトおよび潜在的な結合パートナーを溶液からアフィニティー精製します。まず、ウサギIgG arosビーズを含むTEV切断反応液を遠心分離します。arosをペレット化させるため、分析用に清澄化された上清をOTT分分取します。

これがサンプル4です。ベイトタンパク質を含む残りの上清をすべて慎重に新しいチューブに移します。ここでも、細いピペットを使用してください。

ピペットチップを加工し、上清を可能な限りすべて取り除きます。後続の解析のため、rabbit IgG aros beadsを回収します。これがサンプル5です。

Strep-Tactinビーズの損傷を防ぐため、ピペットチップの先端を切り取ります。ビーズを穏やかに再懸濁し、シリコナイズチューブに分注します。SバッファーでStrep-Tactinビーズを洗浄し、低速遠心分離によって上清を回収します。

各洗浄後。各洗浄後、緩衝液を慎重に除去します。ストレプトアビジンビーズは非常に小さいため、微細なピペットを使用しても容易に流出する可能性があります。

ビーズを構築します。strept adinビーズの洗浄後、TEV切断反応の上清をこれらのビーズに加え、ローテーターを用いて4 °Cで3時間または一晩インキュベートします。

インキュベーション後、遠心分離してstreptavidinビーズを回収し、上清を除去します。これがサンプル6となります。なお、留意してください。

ベイトタンパク質は現在、チューブ内の残りのビーズに結合しています。ベイトタンパク質を含むストレプトアビジンビーズを溶解バッファーで洗浄します。さらなる汚染タンパク質を除去するため、ビーズから残りの洗浄液を取り除き、氷上に置いておきます。

ステップ6、ビオチン溶出です。このステップでは、ストレプトアビジンビーズにビオチンを添加します。ビオチンとストレプトアビジンビーズの相互作用によりベイトが置換され、溶液中に放出されます。

ビオチン溶液をビーズに直接加え、転倒混和します。回転ミキサー遠心機を用いて、反応液を4 °Cで3時間または一晩インキュベートします。ビオチンエアロス混合物を注意深く新しいチューブに回収します。これが最終的なEITとなり、サンプル7と呼ばれます。

残りのstrept haveinビーズはサンプル8となります。タンパク質濃度が低いため、この最終溶出液は分析前に濃縮する必要があります。これは低分子量カットオフのスピンカラムを用いて行い、定期的に工程を確認しながら遠心分離によって容量を減少させます。

この濃縮サンプルを分注し、SDS-PAGEゲルを用いてクマシー染色および銀染色により解析することができます。質量分析で解析を行う場合は、市販のプレキャストゲルを使用することを推奨します。その後、個々のバンドを切り出し、質量分析によってタンパク質を同定することが可能です。

このケースでは、ベイトとしてマウスのEタンパク質に対するEIFを用いました。Tandem Affinity Purification（TAP）システムの利点は、目的のタンパク質を特定の細胞株で発現させることができる点であり、選択する細胞株によって、タンパク質を比較的低レベルで発現させることも可能です。これにより、翻訳後修飾や局在性が保持されるため、多くの場合、天然の複合体を精製することができます。