特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

本実験の目的は、モデル糖タンパク質を用いて、酵素的な脱糖鎖修飾およびn結合型およびO結合型糖鎖修飾の解析におけるglycosateの使用法を説明することです。これは、糖タンパク質をPGA's Fまたはタンパク質脱糖鎖ミックスで処理することで達成されます。また、通常では除去が困難な糖を除去しやすくするため、タンパク質脱糖鎖ミックスにさらなるexo glyco assの混合物を添加しました。

本手法を、モデル糖タンパク質である組換えヒト絨毛性ゴナドトロピンβ（HCG beta）を用いて説明します。まずSDS-PAGEを行い、続いてクマシーブルー染色および糖特異的染色法を実施します。糖鎖付加の状態を解析するためにPro Q Emerald 300を用いました。HCG betaサンプルの解析結果から、糖鎖除去処理の有無によるタンパク質の移動度の違い、および糖鎖が順次除去されるにつれてPro Q染色のシグナルが減衰することに基づき、HCG betaは不均一に糖鎖付加されており、複数の糖鎖形態が含まれていることが示されました。

質量分析などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、簡便であり、一般的な実験器具で実施可能で、糖生物学の初心者に適している点にあります。本法を用いることで、「目的のタンパク質が糖鎖付加されているか」といった、糖生物学分野における重要な疑問を解決できます。酵素的脱糖鎖修飾を開始するには、タンパク質脱糖鎖修飾キットに付属のバッファーを融解してください。

チューブを十分に混合し、室温で保持します。酵素を含むバイアルを氷上に置き、HCG betaバイアルの内容物を600 µLの蒸留水で溶解して氷上で保持します。10倍ストック溶液を蒸留水で希釈して1 XG sevenバッファーを1 mL調製した後、25 µLを用いて0.5 µLのPGA's fを希釈します。

4種類のexo glycosateを各2 µLずつ混合し、exo glycosateミックスを調製します。次に、書面の手順に従い、番号を付けた7本のPCRチューブにHCG betaおよび10x glycoprotein denaturing bufferを加えます。チューブにキャップをして静かに混合し、サーモサイクラーを用いて94 °Cで10分間インキュベートし、続いて4 °Cで保持してタンパク質を変性させます。サーモサイクラーからチューブを取り出した後、遠心分離を行い、各反応チューブ内の目に見える凝縮水を取り除きます。書面の手順に従い、残りの試薬を各チューブに加えます。新しいキャップを使用してPCRチューブを密閉します。

その後、内容物をスピンダウンさせた後、チューブを軽く4回タッピングして混合し、サーモサイクラーに入れて37 °Cで4時間インキュベートします。続いて、サンプルを4 °Cまで冷却します。SDS-PAGEの準備として、新鮮な3×還元剤入りSDSローディングバッファーを用意します。

DTTを含む調製済みの3倍濃度還元SDSローディングバッファーを各サンプルに12.5 µLずつ加え、新しいキャップでチューブを密閉し、軽くタッピングして混合します。サーモサイクラーを用いて94 °Cで5分間インキュベートした後、4 °Cまで冷却します。インキュベーション後、各サンプル30 µLおよびタンパク質マーカー10 µLを10～20%トリ・グリシンゲルにロードします。各サンプルの残量は保存してください。

Dフロントがゲルの底部付近に達するまで、130 Vでゲル電気泳動を行います。泳動が完了したら、キャストからゲルを取り出し、ゲルが完全に浸る十分な量のクマシーブルー染色液を入れた小型プラスチックボックスに移します。緩やかに撹拌しながら1時間染色し、染色の完了を待ちます。

30分間、3回洗浄します。50 millilitersの染色除去液中で、白色光透過照明装置またはスキャナーを用いて画像を記録します。あるいは、ゲルをセロファンシートの間で乾燥させることも可能です。

ゲルの泳動中に、各サンプルの残量およびタンパク質マーカーを10〜20%Tri glycineゲルで泳動します。キットに付属の製品マニュアルに従い、DMFでProQ emerald試薬を溶解させ、染色用のストック固定液、洗浄液、および酸化溶液を調製します。電気泳動が完了したら、キャストからゲルを取り出し、プラスチック製のボックスに入れます。

調製した固定液100 millilitersを加えてゲルを固定します。室温で緩やかに撹拌しながら、一晩放置します。翌日、調製した洗浄液100 millilitersを用いて、室温で緩やかに撹拌しながら10 to 20分間ゲルを洗浄し、新しい洗浄液で再度洗浄を繰り返します。

次に、準備した酸化溶液 25 milliliters 中で、ゲルを緩やかに撹拌しながら 30 分間インキュベートして炭水化物を酸化させます。その後、ゲルの洗浄工程でさらに 2 回洗浄を行います。キットに付属の染色バッファー 25 milliliters に ProQ Emerald 300 試薬溶液 500 microliters を加えて、新鮮な ProQ emerald 300 染色液を調製します。ゲルの染色後、調製した染色液中で、遮光し緩やかに撹拌しながら 90 〜 120 分間インキュベートしてゲルを染色します。

前述した2回の洗浄ステップを繰り返します。その後、300 nanometersのUV透過照明装置を用いて画像を記録します。最後に、クマシー染色したゲルの画像とProQ emerald染色したゲルの画像を比較します。

酵素による脱糖鎖処理後のタンパク質の移行度の変化は、コントロールサンプルとPGAのF処理を比較することで確認できます。n-グリカンを除去するための処理、およびn-グリカンとO-グリカンを除去するための脱糖鎖ミックス処理において、さらにグリコシダーゼで消化してもサイズの減少は見られません。質量の変化に加えて、糖鎖が除去されるにつれてバンドがより鮮明になります。

17 kilodaltonマーカーよりも下に現れるバンドは、おそらく完全に脱糖鎖化されたHCGベータポリペプチドを表しています。レーン5から7には、Glycoに対応するバンドが示されています。その他のバンドは、不完全な脱糖鎖化、あるいはHCGベータサンプル中に存在する未同定の複数のタンパク質に由来する可能性があります。

エメラルドグリーン試薬は、タンパク質分子内に存在するすべての糖鎖を酸化し、染色します。したがって、HCG betaが酵素的に脱糖鎖されるにつれて、シグナルの強度は低下します。レーン3および4に残っているシグナルは、使用した酵素に対して耐性を持つ糖鎖モチーフが存在することを示しています。

4番目のレーンでは、追加のグリコシダーゼを使用します。糖残基を数個除去してください。タンパク質の泳動距離は同じですが、染色の強度がわずかに低下していることが確認できます。

すべてのタンパク質種に耐性糖鎖が存在していたわけではありませんでした。一部のバンドはemerald Greenで検出されず、それらが広範に脱糖鎖修飾されていたことが示されました。追加のデータは、HCG betaが不均一に糖鎖修飾されているという結論を支持しています。レーン2の下方のバンドは、emerald greenの画像では薄くなっています。

レーン2の上部のバンドが明るく、多くのGLYCAN基が依然として存在していることを示していますが、これらのデータは、マウス細胞で発現した組換えHCG betaが、糖鎖付加に固有の不均一性のため、複数の糖鎖形態を含んでいるという結論を支持しています。この手順の後、占有率はどのくらいか、糖鎖付加の程度はどのくらいか、あるいは糖鎖の微細構造はどのようなものかといった、さらなる疑問に答えるために、質量分析などの他の手法を実施することが可能です。

このビデオを視聴することで、糖タンパク質のN結合型糖鎖の酵素的脱糖鎖修飾および分析にglycosylateを使用する方法について十分に理解できるはずです。タンパク質染色領域は、脱糖鎖修飾によって分子量に大幅な変動が生じた場合にのみ有用であるため、検出方法の選択は困難な場合があります。

脱糖鎖修飾後に異常な移行が認められ、移行におけるあらゆる変化は、タンパク質が脱糖鎖修飾されたことの証拠であることが分かりました。