リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

この手順の全体的な目的は、in vitro 無細胞翻訳系で翻訳中に産生される、SEC TED 70 S リボソーム結合新生鎖複合体（RNC）を単離することです。これはまず、目的遺伝子の C末端に 17アミノ酸長の SEC M ストール配列を導入し、T7 転写プロモーターの下流にクローニングすることで達成されます。次に、in vitro 転写反応を用いて mRNA を転写し、精製します。

次に、精製したmRNAを放射性アミノ酸を含む S 30 E coli 抽出液系で翻訳し、合成されたタンパク質または新生ポリペプチドを標識します。最後に、2番目のMr.Edリボソーム結合新生鎖複合体を、ショ糖密度勾配遠心分離および分画によって単離します。最終的に、勾配分画から単離した標識ポリペプチドをゲル電気泳動で分析することで、新生鎖が 70 s リボソームに安定して結合していることを示す結果を得ることができます。

この手法の既存の方法（ストップコドンを欠いたmRNAの使用など）に対する主な利点は、翻訳中およびその後の遠心分離ステップにおいて、新生ポリペプチド鎖を70 Sリボソームに高効率に結合させることができる点にあります。さらに、ストップコドン欠損技術とは対照的に、この方法はin vitroおよびin vivoの両方の系においてほぼ同等の効率で使用可能です。この手法は、翻訳に伴うタンパク質折り畳みの分野における重要な疑問、例えば、翻訳のどの段階でさまざまな翻訳折り畳み中間体が形成されるかといった問いに答えるのに役立ち、さらに直接的または間接的な構造解析を用いてそれらの構造を分析することに寄与します。

プローブおよび決定アプローチ この手法を用いることで、リボソーム上でのタンパク質折り畳みの経路を解明することができます。本プロトコルでは、70 s リボソームに結合した全長 bine gamma B crystalline 新生鎖の単離について記述しました。しかし、この手法は、事実上あらゆる目的タンパク質のさまざまなバリエーションの単離に使用することが可能です。

この戦略は、真核生物の切断された新生ポリペプチド鎖を単離するためにも採用できます。一般的に、この方法に不慣れな方は、ショ糖密度勾配遠心分離のステップで苦労するかもしれません。しかし、経験者にとって、これは問題にならないはずです。ストップコドンを欠いたmRNAを使用する初期の試みでは十分な成果が得られなかったため、私たちは2番目のストール配列を利用して、70Sリボソームに結合したγ-クリスタリン新生ポリペプチドを単離することにしました。

後者の手法では、SECM停止配列を用いた手法と同等の効率で、その後の遠心分離ステップにおけるRNCの安定性を確保することはできませんでした。勾配の調製やRNCの分離を含むステップは習得が困難な場合があり、再現性のある結果を得るには一定レベルの専門知識が必要であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本デモンストレーションは、in vitro転写および翻訳を行う当研究室の大学院生が行います。まず、リボソーム・新生鎖複合体（RNC）を生成するために、T7またはSP6ベースの任意のプラスミドにクローニングされた目的遺伝子を用意します。

標的ポリペプチドのフラグメントがリボソームトンネルから確実に押し出されるように、M由来の停止誘導配列を加えてC末端を延長します。in vitro転写の準備として、タンパク質とSEC M停止配列の間に柔軟なグリシンリッチリンカーを挿入します。オープンリーディングフレームの下流を切断する制限酵素を使用してテンプレートDNAを直線化し、アガロースゲル電気泳動を行ってサンプルの完全な消化を確認します。最適なDNA濃度を確認した後、製造元の指示に従って高収量転写キットを使用し、メッセンジャーRNAを合成します。

塩化リチウム沈殿法を用いてmRNAを精製します。その後、アクリルアミドゲルまたはアガロースゲルでサンプルを電気泳動し、純度を確認します。これはin vitro翻訳用です。

ヌクレアーゼフリー水を用いたE. coliシステムにおいて、メチオニンを除く1 mMのアミノ酸混合物、10 unitのリボヌクレアーゼ阻害剤、20 µCiの³⁵S-メチオニン、20 µLの反応ミックス、24 µLの再構成バッファー、および24 µLのE. coliライセートを加えます。反応液を30 °Cで5分間インキュベートして予熱します。その後、1〜2 µgのmRNAを加え、30 °Cでさらに10〜15分間インキュベートします。

反応液を氷上に置いて反応を停止させ、70 sリボソーム結合新生鎖複合体（nc）を単離します。翻訳反応液を、20 millimolar HEPES-カリウム緩衝液（pH 7.5）、15 millimolar マグネシウム、100 millimolar 酢酸カリウム、および 1 millimolar DTTを含む5〜30% ショ糖密度勾配 4.5 milliliters の上層に重ねます。4 °Cで41,000 RPMにて2時間遠心分離します。遠心分離後、プログラム可能な密度勾配分画システムと 254 nanometers に設定した吸光度検出器を用いて、ショ糖勾配を分画します。

SEC M延長タンパク質が70 sリボソームに結合したままであるかを確認するため、70 sリボソームを含む画分を回収して詳細な解析に用います。各グラジエント画分にトリクロロ酢酸を加えてタンパク質を沈殿させます。サンプルを4 °Cで一晩インキュベートし、翌日、14,000 ×gで15分間遠心分離してタンパク質をペレット化します。その後、アセトンと1 mM Tris-HCl (pH 7.6) を4:1の比率で混合した溶液でペレットを洗浄します。

ペレットを風乾させた後、SDSページ用ロードバッファーで再懸濁します。Tris-Tricine SDS-PAGEでサンプルを分離し、ゲルの固定および乾燥を行い、ここに示すようにオートラジオグラフィーおよびリン酸化イメージングに供します。in vitro翻訳後、γBクリスタリンタンパク質がリボソームに安定して結合していることを確認するため、ショ糖密度勾配遠心法および分画法によって70 Sリボソームを単離しました。

70 sを含む画分を回収し、脱塩およびバッファー交換を行った後、再度ショ糖密度勾配遠心分離にかけた。ここに示す結果は、SEC MがγBクリスタリンRNCの翻訳停止を効率的に誘導できることを示唆している。この手法に習熟すれば、新生鎖のゲル電気泳動分析（通常、一晩のTCA沈殿ステップを伴う）を除き、1営業日で完了させることができる。

この手順を行う際は、あらゆる段階でRNAの混入を避けることが極めて重要です。RNAが混入すると、抽出液の翻訳効率に影響を及ぼし、70Sリボソームから新生ポリペプチドが解離する可能性があります。最終的な目的応じ、本手順に従うことで、70Sリボソームに安定的に結合したNASTおよび所定の長さのポリペプチドを得ることができます。

これらの複合体は、NMRやFRETなどの直接的または間接的なアプローチを用いたリボソーム結合新生鎖の構造決定や、作製後の因子およびリガンド結合の試験など、さまざまな目的に利用できます。この手法により、構造生物学およびタンパク質折り畳みの分野の研究者が、リボソームに結合した全長タンパク質の構造や、共翻訳的な折り畳み中間体を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、翻訳タンパク質折り畳みの分野におけるさまざまな疑問を解決するために利用可能な、70 S リボソームに安定して結合した新生ポリペプチドの調製および単離方法について、十分な理解を得ることができるはずです。

放射性同位体や、例えば [35S] メチオニンのような標識アミノ酸を取り扱う際は、特別な注意が必要であることに留意し、本手順の遂行中は常にこれを考慮してください。