ヒト血液の小さなサンプルから単球および樹状細胞のlineage特異的Toll様受容体を介するシグナル伝達の定量的イメージング

本実験の全体的な目的は、イメージストリーム技術を用いて、明確に定義された患者コホート由来の一次免疫細胞における細胞メカニズムを定量化する方法を実証することです。まず、患者または健康なボランティアから採取した血液サンプルから末梢血単核細胞（pbmc）を分離します。分離後、細胞を活性化させ、蛍光標識を行います。

次に、細胞を流体力学的にフォーカスし、レーザー光で励起させ、時間遅延積分（TDI）CCDカメラで撮像します。最後に、イメージストリームサイトメーターを用いて画像を解析し、NF kappa bを定量します。

各細胞画像のトランスロケーションは、ideasソフトウェアを用いて行います。最終的に、ドットプロット、ヒストグラム、および細胞画像の解析を通じて、各被験者群間の差異を決定することができます。イメージストリームの利点は、フローサイトメトリーのデータと免疫蛍光を組み合わせることができる点にあります。

私たちは、少量の血液サンプルから、単一細胞または集団のいずれかにおいて、系統特異的な方法で細胞シグナル伝達経路を解析することが可能です。この手法は、シグナル伝達介在体を局在化および定量化することで、知見における重要な疑問への回答に寄与します。例えば、転写因子の核内移行を介した作用の調査や、細胞生物学に対する加齢の影響の検討に利用できます。

当研究室のリーダーが、ヒトボランティアから得られた末梢血単核細胞を分離した後、本手法を実演します。回収したPBMCを、培地0.6 mLあたり3×10⁶ cellsの密度で再懸濁し、細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移します。次に、細胞の一部をここに示すTLR8作動薬であるR848などの活性化剤で刺激し、すべての細胞を5% CO₂インキュベーターにて37 °Cで10〜60分間インキュベートします。

インキュベーション後、室温で500 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を捨てます。単球またはDC系に特異的な表面抗体カクテルを用いて、4 °Cで20分間細胞を標識します。この際、コンペンセーションコントロールとして使用する、単色コンジュゲートで標識した細胞チューブも含めてください。その後、4% PFA-PBSを用いて室温で10分間細胞を固定します。室温で500 ×gで10分間遠心分離した後、PBMCを凍結保存バッファーで再懸濁し、アッセイ当日の解析まで-80 °Cで保存します。

37 °Cのウォーターバスで細胞を迅速に融解し、遠心分離して凍結保存液を除去した後、100 µLのBD perm wash bufferで透過処理を行います。次に、ここに示したanti NF kappa BP 65抗体などの細胞内シグナル伝達成分に対する抗体を用いて、室温で20分間ラベルします。細胞をペレット化した後、goat anti rabbit IgGを含む100 µLのBD perm wash bufferで再懸濁します。

Alexa 647を加え、PBMCを室温でさらに20分間インキュベートします。イメージングの直前に、核染色剤で細胞を対比染色します。まずImageStreamの電源を入れ、Inspireソフトウェアを起動します。次に、[load default template]をクリックし、[initialize fluidics]を選択します。

次に、イメージギャラリーメニューをクリックして「すべて選択」を選択します。続いて「セットアップ実行」を押し、ビーズのイメージングを開始してから、明視野チャネルを選択します。スピードビーズの走行が開始されたら、「アシスト」タブにある「すべて開始」をクリックして、装置の校正とテストを行います。

ImageStreamシステムのキャリブレーション後、「flush, lock and load」を押し、最も輝度の高いサンプルを装置にロードします。次に、ドットプロットで測定した各フローラクロームの最大ピクセル値が104,000カウントになるようにレーザー出力を設定します。その後、細胞の分類基準を設定します。

次に「run」および「acquire」をクリックして、実験データファイルを収集し保存します。データファイルを解析するには、まず解析ソフトウェアを開きます。補正済み画像ファイルを作成し、核染料強度が正常で、核染料アスペクト比が高いイベントでゲートを設定します。R1ゲート内の単一細胞をデブリや多細胞イベントから区別するため、CD14陽性細胞のゲート内で単球を特定し、CD11cが高く、CD4およびlin1マーカーが低い骨髄性樹状細胞をR3ゲートで特定します。

最後に、IDEASソフトウェアを使用して、細胞質転写因子NF kappa Bと核染色剤の共局在を判定します。NF kappa Bと核染色剤の高い相関は、2つのマーカーの共局在を示しており、これは高い類似度スコアとして反映され、細胞の活性化 degree を示します。異なる治療群または患者集団間における高い類似度イベントの割合を比較することで、細胞の相対的な機能効率を評価できます。

次に、ソフトウェアを使用して、集団ヒストグラムの主要なセグメントから細胞の画像を表示させます。ImageStreamを用いることで、pbmcから細胞サブセットを直接ゲーティングし、ゲート設定済みでソートされていない細胞集団からの細胞応答をイメージングすることが可能です。ここでは、lin-、CD4-dim、CD11c+の骨髄系DCにおける、TLRシグナル伝達がNF kappa BP 65の核移行に及ぼす影響をベースラインで定量化しました。

刺激前の細胞では、転写因子NF kappa B p65が細胞質に存在する高い割合で観察されました。刺激後、処理された細胞ではNF kappa B p65と核染色剤PIとの類似性スコアが有意に高く、刺激後にNF kappa B p65が核内へ移行したことが示されました。未処理の細胞集団とR 8 48刺激細胞集団から同時に収集したデジタル画像には、代表的な細胞と、細胞核に移行したNF kappa Bの強度が表示されています。未処理の細胞と比較して、R 8 48刺激群におけるNF kappa BおよびPI染色の強度がより明るくなっていることに注目してください。

我々はこの手法を異なる年齢のドナー由来の細胞に適用し、TLRを介したNF kappa B活性化経路に差異があることを示しました。この手法を習得すれば、画像解析に要する時間を除き、1日以内に完了させることができ、複数の局在画像と集団統計の両方を得ることが可能です。さらに、物理的な分離を行うことなく、複数の細胞集団からの応答を直接イメージングできます。Image streamは多くの細胞メカニズムに幅広く適用でき、トランスレーショナルリサーチにおいて非常に有用であると考えられます。