超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法
2018年6月14日
ここで開発および単一分子配列デジタル ELISA 法、人間のサンプルですべての IFN-α サブタイプの超高感度検出を可能にする検証を記述するプロトコルを提案する.
この方法は、自己免疫や感染など、さまざまな疾患環境におけるインターフェロン誘発応答の性質、調節、および生物学的影響に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、それ自体が社長の感度です。この技術は、これまでにない感度でサイトカインを定量化できるため、多くの疾患における患者管理を改善するバイオマーカー発見に大きな可能性を
秘めています。このアプローチの主なステップは、自己免疫性ポリインドクリン系タイプ1の患者に関連する活動を中和することでした。まず、2億8,000万個の常磁性ビーズをマイクロチューブにロードし、その量に注意してください。次に、ビーズをパルス回転させ、チューブを磁気セパレーターに1分間置きます。
希釈剤溶液を取り外して廃棄し、ビーズを分離します。次に、ビーズをBWBで2回、BCBで2回洗います。洗浄するたびに、200マイクロリットルを追加し、チューブを5秒間ボルテックスします。
次に、磁気セパレーターを使用してビーズを溶液から分離します。1分間分離した後、希釈剤を廃棄します。次に、ビーズ体積あたり190マイクロリットルのBCBを追加します。
次に、チューブを短時間ボルテックスし、チューブをパルス回転させ、洗浄したビーズを氷の上に置きます。ビーズを活性化するには、1ミリリットルの冷たいBCBと10ミリグラムのEDCを組み合わせ、溶液が均一になるまでボルテックスします。EDCを使用すると、その固有の不安定性と公平性ソリューションにより、迅速かつ安全に作業できます。
次に、ビーズ懸濁液にビーズ容量あたり10マイクロリットルの冷たく希釈したEDCを加え、ビーズを短時間ボルテックスします。次に、ビーズを室温のシェーカーに30分間置きます。抗体をビーズに結合させるために、まずボルテックスとパルスが活性化されたビーズを回転させます。
次に、ビーズを磁気セパレーターに1分間入れ、BCB上清を捨てます。次に、チューブを磁石から取り外し、ビーズを200マイクロリットルのBCBで2回洗います。次に、渦巻き、パルススピン、およびビーズを磁気的に分離してバッファを除去します。
次に、200マイクロリットルの冷たい緩衝液交換抗体を活性化ビーズにすばやく加えます。溶液にビーズをボルテックスした後、懸濁液を室温シェーカーに1, 000 RPMで2時間置きます。まず、抗体でコーティングしたビーズ懸濁液にパルススピンを与え、次に磁気カラムを使用してバッファーを除去します。
次に、バッファー中のタンパク質の濃度を確認します。低容量の分光光度計を使用してください。この時点で、抗体はビーズに結合しており、ゼロを超える値はビーズが抗体で飽和していることを意味します。
次に、以前のすべての洗浄で行われたように、200マイクロリットルのBWBでビーズを洗浄します。次に、上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度を確認します。ビーズから放出されるタンパク質を定量化することで、抗体のカップリングを測定することができます。
その後、ビーズを再び200マイクロリットルのBWBで洗います。次に、200マイクロリットルのビーズブロッキングバッファーを追加し、チューブを5秒間ボルテックスし、室温のシェーカーに30分間移します。30分後、ビーズはブロックされます。
その後、200マイクロリットルのBWBで1回洗浄し、その後、200マイクロリットルのビーズ希釈液バッファーで2回洗浄します。次に、コーティングしてブロックしたビーズを、摂氏4度の200マイクロリットルのビーズ希釈液バッファーに保管します。ビデオのこのセクションでは、自家醸造構成で single molecule array analyzer ソフトウェアを使用してアッセイ条件を微調整する方法の戦略を提案します。
まず、捕捉抗体標識ビーズとビオチン化検出抗体のさまざまな組み合わせを、両方の抗体の組み合わせで試験します。次に、3つの異なる捕捉抗体濃度と2つの異なるビオチン化比の組み合わせを試験し、検出と捕捉抗体、またはその逆を行います。次に、検出レベルが最も低い組み合わせを選択し、それを以降の手順に使用します。
この場合、ビオチンと抗体の比率が30対1の場合、検出の限界が最適になります。次に、2 ステップ構成と 3 ステップ構成を比較します。3ステップ構成には、3つの異なるインキュベーションステップがあります。
1つは捕捉抗体、1つは検出抗体、そして最後に3つ目はSBG酵素標識用です。2ステップ構成では、捕捉と検出のインキュベーションが組み合わされています。選択した捕捉抗体と検出器抗体の濃度と配給量を、メーカーの指示に従って分析装置で事前に設定された2ステップおよび3ステップの構成で使用して、1分子アレイ分析装置を実行します。
次に、最高の感度を可能にする構成を選択し、将来のステップのために保持します。この場合、2ステップ構成では、すべてのテストポイントでわずかに高い感度が得られます。次に、検出器抗体とSBGの濃度を最適化します。
3つの異なる濃度の検出器抗体を、3つの異なる濃度のSBGで試験します。最高の感度が得られる濃度を選択し、将来のステップのためにそれらを保持してください。この場合、抗体1ミリリットルあたり0.3マイクログラムと150ピカモルのSBGは、偶然の中振幅でバックグラウンドレベルが低く、最適な検出レベルが得られます。
その他の最適化手順については、テキスト プロトコルを参照してください。そこには、アッセイの特異性と再現性を最適化するための手順と、タンパク質競合のためのアッセイがあります。インターフェロン-αの13のサブクラスを検出するために最適化されたアッセイを使用して、SLE患者、JDM患者、および健康なコントロールで血漿と血清を分析しました。
高レベルのインターフェロン-αタンパク質が両方の疾患コホートで検出されました。.点線は、これらの疾患におけるこのサイトカインの既知の役割にもかかわらず、これらの患者グループでインターフェロンαタンパク質を検出しない従来の市販のElizaの検出レベルを示しています。このビデオを見れば、選択した解析のための単一分子アレイアッセイの開発方法とバリデーション方法について十分に理解できるはずです。
この手順を試みる際には、細胞内で抗体を選択することを覚えておくことが重要です。開発以来、このアッセイは、多様な自己免疫疾患および感染症におけるインターフェロンαの役割をより良く特徴づけることを可能にしてきました。このアッセイは、新しい治療法に対する反応をモニターし、特定の自己免疫疾患の原因となる細胞アクターを特定するのにも役立っています。
概要
本記事では、ヒト試料中のすべてのIFN-伪サブタイプを超高感度に検出することを可能にする、シングル分子アレイデジタルELISAアッセイの開発およびバリデーションのためのプロトコルを紹介します。この手法は、さまざまな疾患におけるインターフェロン誘導性応答を理解するために特に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- バイオマーカー探索
背景
- インターフェロンαは免疫応答において極めて重要な役割を果たします。
- 既存の手法では、低濃度のサイトカインを検出するために必要な感度が不足しています。
- 本研究は、より適切な患者管理を実現するため、検出能力を向上させることを目的としています。
- 自己免疫疾患および感染症が主な焦点となる領域です。
研究目的
- IFN-伪サブタイプを検出するための高感度アッセイを開発すること。
- 疾患におけるインターフェロン応答の生物学的影響を探索すること。
- 臨床転帰を改善するためのバイオマーカー探索を促進すること。
使用方法
- 抗体結合用常磁性ビーズの調製。
- シングル分子アレイ分析装置ソフトウェアを用いたアッセイ条件の最適化。
- 感度評価のためのさまざまな抗体組み合わせの検討。
- 患者およびコントロールの血漿および血清サンプルの分析。
主な結果
- SLEおよびJDM患者において、高レベルのインターフェロンαが検出されました。
- 本アッセイは、従来のELISAと比較して優れた感度を示しました。
- 抗体の結合および検出における最適条件を確立しました。
結論
- 開発されたこのアッセイは、インターフェロン応答を研究するための強力なツールとなります。
- 自己免疫疾患の診断および管理に応用できる可能性があります。
- さらなる最適化により、特異性と再現性を向上させることができます。
よくある質問
業界における重要性
アトモモル濃度におけるヒトインターフェロン-α (IFN-α) の超高感度定量は、自己免疫疾患および感染症研究におけるサイトカインバイオマーカー検出の重要な課題を解決します。このデジタルELISAプラットフォームは、13種類すべてのIFN-αサブタイプを検出可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカー探索およびバイオファーマの早期パイプラインにおけるメカニズム的なリスク低減を支援します。検証済みの本アッセイは、ターゲットエンゲージメントおよび疾患モニタリングの予測信頼性を向上させ、ポートフォリオの優先順位付けおよび推進の意思決定に直接的に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- IFN-αの精密な定量化を可能にし、サイトカインが駆動する疾患メカニズムの解析を実現します。
- ヒト試料におけるIFN-αサブタイプの識別により、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 免疫調節療法の仮説におけるメカニズム上のリスク低減を促進します。
- パスウェイ調節およびターゲットエンゲージメント研究における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 高感度なサイトカイン検出のための、検証済みで再現性のあるデジタルELISAプラットフォームを提供します。
- 堅牢なダウンストリームワークフローを実現するため、アッセイ構成と抗体選択を標準化します。
- 多様な生物学的マトリックスにおけるIFN-αレベルの、定量的なコホート間比較を可能にします。
- 信頼性の高い化合物スクリーニングおよびバイオマーカー評価に向けて、生物学的システムを準備します。
翻訳および前臨床研究
- 患者由来サンプルの検出を可能にすることで、トランスレーショナルバイオマーカー戦略と整合させます。
- 自己免疫疾患および感染症モデルにおける、発見から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- IFN-α経路を標的とする候補療法の進展に向けて、リスク調整後のデータを提供します。
- 低存在量のサイトカインダイナミクスを捉えることで、疾患に関連したシステムモデリングを強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このデジタルELISA法は、初期探索からトランスレーショナルリサーチまでを統合し、R&D（研究開発）の全過程における仮説検証、ターゲットバリデーション、およびバイオマーカーに基づく意思決定を可能にします。
- 探索生物学：IFN-αを介した応答に関する帰無仮説の検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：定量的なサイトカイン測定におけるアッセイの準備状態と再現性を提供します。
- 分析：アトモモルレベルの感度とマルチプレックスなサブタイプ検出により、堅牢なデータ出力を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：患者試料におけるバイオマーカーの整合性を可能にすることで、探索研究と前臨床研究を橋渡しします。
- 企業内での再利用：多様なサイトカインおよびバイオマーカープログラムに向けた、再利用可能な高感度プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 免疫経路研究における予測の信頼性を高め、メカニズムに関する曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 再現性と拡張性のあるワークフローにより、超高感度なサイトカイン定量化を標準化します。
- 戦略的価値： 早期段階のプログラムのリスクを低減することで、Go/No-go判断を導き、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 免疫調節資産のリスク調整済み優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 抗体の選択、コンジュゲーション、およびデジタルELISA機器に関する専門知識が必要です。
- シングル分子アレイ分析装置および堅牢な分析インフラストラクチャへのアクセスが不可欠です。
- アッセイパラメータおよびデータ解釈におけるチーム間の標準化が必要です。
- さまざまな生物学的マトリックスに適応可能ですが、抗体の特異性とサンプルの品質に依存します。
- 実用上の制限として、各新規ターゲットに対するアッセイ構成の最適化とバリデーションが含まれます。
