生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

このビデオでは、UV光を用いて細胞膜におけるタンパク質の活性を制御する方法を実演します。この手法では、細胞に膜結合型FRBタンパク質と、目的のタンパク質に融合させたFKBPタンパク質を共導入（コトランスフェクション）します。その後、培地にフォトケージド・ラパマイシン誘導体を追加します。

その後、生細胞イメージング中に、細胞の特定の領域にUV光を照射します。ラパマイシンとビオチンの間のリンカーが切断されて化学的ダイマライザーとその副産物が放出され、放出されたダイマライザーが細胞内に拡散し、照射領域においてFKBP標識標的タンパク質と細胞膜に固定されたFRBとの二量体化を誘導します。UV照射がない場合、FKBPとFRBは会合せず、したがって効果は現れません。

データの解析により、目的のFKBP融合タンパク質が、その生理学的な効果に基づき、高度に局所的にリクルートされることが明らかになりました。薬理学的および遺伝学的アプローチなどの既存の手法に対する本技術の利点は、作用速度、標的特異性、および空間分解能を兼ね備えていることです。本技術の意義は、がん細胞の遊走の結果として生じるがんの転移治療への応用にまで及びます。

したがって、主要な遊走因子の活性を操作することで、その正確な分子メカニズムを明らかにできる可能性があり、これは治療および完治のための前提条件となります。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるChris Paul Meyerと、技術者のBob de Roseが行います。まず、滅菌済みマイクロ遠心チューブに、プラスミドDNA、膜結合型FRB、蛍光タグ付きFKBP、TIA1、および脱イオン水を混合することからこのプロトコルを開始します。この混合物に1 µLのa few gene HDを加え、ボルテックスします。

チューブを室温で20分間インキュベートします。インキュベーションの間に、ガラス製8ウェルチャンバースライドの各ウェルにpoly-L-lysineを50 µL加え、表面をコーティングするために1分間インキュベートし、その後、溶液を吸引して各ウェルの中央を50 µLの脱イオン水で洗浄します。次に、80～85%コンフルエントになったNIH 3T3細胞をトリプシン処理します。

細胞を剥離させた後、10% FBSを含むDMEMを10 milliliters加え、懸濁液375 microlitersを15 milliliterの滅菌チューブに移し、1,500 Gで3分間遠心分離します。遠心後、培地を慎重に吸引します。10% FVSを含むDMEMを750 microliters加え、再懸濁します。

ピペッティングで数回穏やかに上下に混ぜ、ペレットを懸濁させます。最後に、細胞懸濁液をトランスフェクション溶液に加え、ピペットチップを用いて穏やかに撹拌し、チャンバーの各ウェルに細胞トランスフェクション懸濁液を 250 microliters ずつ分注します。その後、スライドさせてインキュベートします。

37 °Cで15～18時間。ケージラパマイシン・ビオチン付加体を合成します。まず、滅菌済みフージチューブ内でDMSOを用いてCRBの1 mMストック溶液を調製します。別の1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、1 mgのavadonを250 µLのPBSに溶解させます。

次に、ケージング部位をラパマイシンに接合します。溶解させたAVIDに0.5 µLのCRBストック溶液を加え、数回反転させて混合した後、室温で15分間インキュベートします。未結合の低分子を除去してCRB-AVID接合体を精製するため、G 25サイズ排除カラムを300 µLのPBSで平衡化します。

カラムの平衡化後、この操作を5回繰り返します。CRBA溶液125 µLをカラムのセンターベッドにロードします。次に、室温で800 ×gにて2分間遠心し、細胞のトランスフェクション後、流出液を1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに回収します。

培地をFBS不含のDMEMに交換し、細胞を血清飢餓状態にして12時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を穏やかに吸引し、調製した1 µMのCRBA溶液を250 µL添加します。次に、生細胞におけるタンパク質のダイナミクスを可視化するため、365 nmのUV LED光用の光学系を結合したUV照明付き回転円盤共焦点顕微鏡を使用します。

エピ蛍光光を用いて、UV光で励起される蛍光色素をコーティングしたガラスプレートを使用し、照射スポットの座標とサイズを定義します。これにより、照射領域の微調整が可能になります。

細胞を播種したチャンバースライドを、100倍の対物レンズとエピ蛍光照明を用いてステージ上に設置します。細胞にピントを合わせ、観察対象となる細胞を探します。イメージングについては、生理的効果の背景レベルを確認した後に開始してください。

ここでは、細胞の選択した1つの象限にUV光を照射してアンケイジ化し、膜ラッフルを測定します。まず、DMSOにラパマイシンを溶解させ、次いでPBSで最終濃度が400 nanomolarになるように希釈します。この溶液100 microlitersをイメージングチャンバーに添加し、全体的な影響を誘導します。RACの局所的な活性化が局所的なラッフルの形成を誘導できるかを確認するため、20分間にわたって15秒ごとに蛍光画像を取得します。

NIH 3T3細胞に、YFPタグ付きのRAC活性化因子FKbp、TIA1、および膜結合型のLDRをトランスフェクションしました。黄色い円で示された細胞端でのFRB局所照射後、1063秒から水銀ランプを用いて1秒間の全視野照射を行いました。ここでわかるように、開始時点では膜ラッフルはほとんど認められませんでした。

しかし、局所的な光照射の後、全域への光照射およびrapamycinの添加を行うと、空間的に限定されたラッフル形成が観察されました。rapamycinはFKbp-TIA1の細胞膜への移行を誘導します。細胞に全域的なラッフル形成が見られたことは、以前に観察された局所的なラッフル形成が、空間的に限定されたRacの活性化によって引き起こされたことを示しています。定量分析を行うため、標的細胞を4つの象限に分割し、このグラフに示すように、局所刺激および全域刺激後の各象限におけるラッフル形成の頻度を決定しました。

放射線照射なし、または局所的な放射線照射のみ、あるいはバルク培地中でAdenの有無にかかわらず放射線照射を行った場合、CRBA存在下でラッフル形成を示した細胞は観察されませんでした。しかし、CRBAを添加してUV照射を行ったところ、全領域に放射線照射した場合はすべてのクアドラントでほぼ同程度の約90%のラッフル形成が見られました。一方、クアドラント1のみに照射した場合は、クアドラント1でのラッフル形成頻度は100%であったのに対し、クアドラント2から4ではそれぞれ30%、25%、30%でした。これらの結果は、ラパマイシンの局所的なアンケージングにより、単一細胞内において高度に局在化した生理的効果を誘導できることを示しています。

このケースでは、rackの活性化によって膜ラフリング（membrane ruffling）が誘発されています。このビデオを視聴することで、光を用いて小型GTPaseの活性を時空間的に制御する方法を十分に理解できるはずです。この手法は、特定のタンパク質の細胞膜への移行に依存するあらゆる生理学的プロセスに適用可能です。

本手順を行う際は、各操作ごとに溶液、試薬、および細胞を調製し、新鮮な状態で使用することが重要です。また、UV光の取り扱いは極めて危険であるため、UVカットグラスなどの保護具を常に着用し、十分な注意を払ってください。