の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

この手順の全般的な目的は、モデル生物である bacillus subtles のバイオフィルム内で分化する、特化した細胞の異なるサブポピュレーションを可視化し、定量化することです。これは、まず B subtles の染色体に転写リポーターを挿入することで達成されます。これらのリポーターは、研究対象となる細胞のサブポピュレーションにおいてのみ発現します。

次のステップは、バイオフィルム誘導培地（Ms GG gg）で B subtles を培養し、バイオフィルムの形成を促進することです。バイオフィルム形成後、バイオフィルム中の細胞を分散させ、パラホルムアルデヒドで固定します。本手順の最終ステップでは、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて、微生物コミュニティの単一細胞から放出される蛍光信号を検出します。

最終的に、これらの結果は、産生と分泌に特化した細胞がどのように機能するかを示しています。バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを産生する細胞は、マトリックス産生細胞への分化を誘導するシグナル分子である界面活性剤を分泌する細胞とは異なるサブポピュレーションです。バイアビリティアッセイやマイクロアレイ解析を用いた転写発現の定量化などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一細胞レベルで遺伝子発現をモニタリングでき、特定の遺伝子を発現することに特化した極めて少数の細胞集団を可視化できる点にあります。

これらの遺伝子発現は、集団全体を解析した場合には検出されません。B subtlesの標識には統合プラスミドが使用されており、その例をここに示します。PTAAは、tassの産生を担う遺伝子のプロモーターです。

制限酵素Eco RIおよびHind IIIを用いて、マトリックスタンパク質をベクターにクローニングします。これにより、CFPレポーター遺伝子の発現がptapAの制御下に置かれます。B. subtilisの標識手順を開始するために、まず酵素消化によってインテグレーションプラスミドを線状化します。推奨される制限酵素はXho Iです。インテグレーションプラスミドの準備が整ったら、B. subtilis株168の細胞をコンピテンス誘導培地で37 °Cで5時間培養し、自然形質転換能を誘導します。

線状化したプラスミドをコンピテントB subtilis細胞の培養液に加え、37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、スペクチノマイシンを含むアガープレートに細胞を播種し、37 °Cで一晩インキュベートします。B subtilisの染色体には、バイオフィルムの形成に影響を与えることなくレポーター融合遺伝子を組み込むことができる、Amy EおよびLAC Aという2つのニュートラル遺伝子座が存在します。線状化したPKM 0 0 8プラスミドは、二重組み換えによってB subtilisのゲノムに組み込まれます。

次のステップは、SPP oneファージ導入法を用いて、標識株からバイオフィルム形成能を持つ株へレポーターを導入することです。本ビデオでは、プロトコル中の重要なステップのみを示します。レポーター融合遺伝子を保持するドナー株1 68を、TY培地を用いて37°Cで培養し、培養液が定常期早期に達するまで増殖させます。その後、ガラスチューブ内で200 µLの細胞に100 µLの希釈ファージストックを加えます。

その後、37 °Cで15分間静置します。次に、温めたTYソフトアガーをチューブにピペッティングし、ボルテックスミキサーで十分に混合します。これを新しいTYプレート上に穏やかに塗り広げ、37 °Cで8〜16時間インキュベートし、ファージハローを形成させます。

ファージハローを回収するため、プレートに3 mLのTY培地を加え、ガラスピペットを使用してトップアガーを砕きます。アガー懸濁液を15 mLファルコンチューブに移します。ボルテックスで穏やかに撹拌してアガーを分散させ、その後、1000 Gで15分間遠心分離します。

上清を新しいチューブに移します。この上清を0.22 µmのシリンジフィルターでろ過します。得られた上清を用いて、TY培地で培養した受容菌株に感染させます。

10倍に希釈した培養液10 millilitersに、上清30 microlitersを加え、37 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。その後、5,000 RPMで7分間遠心分離し、ペレットを200 microlitersのTY培地で再懸濁させ、SPECTmycinおよび10 millimolarのクエン酸ナトリウムを含むプレートに塗布します。

37 °Cで12〜36時間インキュベートします。コロニーを1つ選択し、37 °Cの液体LB培地で一晩培養します。最後に、一晩培養した液を3 µL、固体のバイオフィルム誘導培地にスポットします。

細胞を30 °Cで72時間培養します。3日間の培養後、Ms.GG寒天培地の表面に形成されたバイオフィルムは、培地表面に複雑な形態学的構造を発達させます。この手順を開始するには、爪楊枝またはピンセットを使用して、MSGG寒天培地の表面からバイオフィルムを取り除きます。

バイオフィルムの凝集性は、寒天表面から剥離させることが可能な程度である必要があります。バイオフィルムをひと塊のまま3 mLのPBSバッファーに入れ、穏やかに分散させます。単一細胞解析の前処理として、出力3、振幅0.7秒の設定で12回のパルス処理を行い、サンプルを固定します。

細胞懸濁液300 µLを1 mLの4%パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁し、室温で正確に7分間インキュベートします。7分間の固定後、PBSバッファーで細胞を3回洗浄します。最後に、蛍光顕微鏡観察の前に、細胞を300 µLのPBSバッファーに再懸濁します。

顕微鏡スライドの上に0.8% agrosを200 µLピペッティングし、別のスライドで慎重に覆うことでスライドを準備します。2分後、上のスライドをそっと取り除き、下のスライド上にagrosの層を形成させます。agros層の表面に固定細胞を2 µL滴下し、顕微鏡用カバーガラスで覆います。

サンプルを蛍光顕微鏡のステージに設置します。実験に選択した条件下で蛍光を示さない陰性対照に従って、励起時間を設定してください。露光時間は50から200 millisecondsの間にする必要があります。

各視野について、蛍光画像と明視野画像の両方を取得します。フローサイトメトリー解析に向けて細胞を調製するため、固定細胞のサンプルを穏やかな超音波処理で分散させます。細胞溶解を引き起こさずに凝集塊を単一細胞に分散させるため、出力5、振幅0.7秒の条件で12パルスの処理を2回繰り返します。

光学顕微鏡を用いて細胞分散の効率を確認します。次に、サンプルをPBSバッファーで100倍に希釈します。YFP蛍光の解析には、BD FACSCanto II フローサイトメーターを使用します。

CFP蛍光には、488 nmのレーザー励起と530/30フィルターを用います。405 nmのレーザー励起と408/40フィルターを用いて、2つの陰性コントロールでフローサイトメーターを校正します。細胞を懸濁していないPBSバッファーのサンプルを、フローサイトメーターで検出される粒子サイズの陰性コントロールとして使用してください。

蛍光レポーターを含まないサンプルを、フローサイトメーターの蛍光感度のネガティブコントロールとして使用してください。キャリブレーション後、蛍光レポーターで標識した各サンプルをフローサイトメーターにセットし、流速を303,000 events per secondに設定して、少なくとも50,000イベントを解析します。B Subtlesをバイオフィルム誘導培地（MSGG）のプレート上で培養し、30 °Cで3日間インキュベートすると、バイオフィルム形成が観察されます。

バイオフィルムは、関与している細胞の異なるサブポピュレーションを示す複雑な形態学的構造を呈します。例えば、細胞外マトリックスとバイオフィルムの産生により、コロニーの表面にしわが形成されます。この図は、蛍光顕微鏡を用いて単一の標識株における細胞分化を可視化した例を示しています。

この株は蛍光リポーターPtap, A CFPを保持しており、青色で着色されたマトリックス産生細胞のサブポピュレーションで発現します。このサブポピュレーションが、バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを産生および分泌します。次の画像は、リポーターPtap, A CFPと、追加のリポーターP Surfactin YFPを保持する二重標識株を蛍光顕微鏡で可視化した結果です。

この2番目のレポーターにより、マトリックス産生細胞の分化に向けたシグナル伝達カスケードを誘発するシグナル分子サーファクチンの分泌を担う細胞集団のモニタリングが可能になります。ここでは、レポーターptapを保持する単一の標識株を用いた2Dフローサイトメトリーの結果が示されており、マトリックス産生細胞は青色に、サーファクチン産生細胞は黄色に擬似着色されています。ここではYFBが提示されています。

蛍光タンパク質遺伝子を持たない未処理のコントロール株では、ptapを保持する低相対蛍光細胞の単一の集団が示されました。非バイオフィルム誘導条件下でのYFPでは、マトリックス産生細胞のサブポピュレーションは分化せず、集団全体が低相対蛍光を示しました。対照的に、バイオフィルム誘導条件下では、低相対蛍光の右側にショルダーとして、高相対蛍光を持つ細胞のサブポピュレーションが検出されました。

3Dフローサイトメトリーから得られたピーク結果をここに示します。モニタリングしたチャネルの蛍光信号を、X軸にYFP、Y axisにCFPとして提示しています。左上のパネルは、背景蛍光のコントロールとして蛍光タンパク質遺伝子を持たない株を示しています。右上のパネルでは、単一標識株を用いて、黄色い枠で囲まれたYFP蛍光チャネルにおけるサーファクチン産生菌のサブポピュレーションを検出しました。

左下のパネルでは、別の単一ラベル株を用いてマトリックス産生細胞のサブポピュレーションを検出しています。青色の枠で囲まれたCFP蛍光チャンネルでは、二重ラベル株を用いてマトリックス産生細胞と界面活性剤産生細胞のサブポピュレーションをモニタリングしており、その結果をこの右下のパネルに示しています。

蛍光レポーターを高レベルで発現している2つの細胞サブポピュレーションが検出されます。それぞれの集団が枠で囲まれており、これら2つの分化した細胞サブポピュレーション間でレポーターの発現に重複がないことが示されています。この最後の図は、3Dフローサイトメトリーによるマトリックス産生細胞とカニバル細胞のサブポピュレーションの定量結果を示しています。

右上のパネルでは、単一のラベル付き株を用いて共食い個体のサブポピュレーションを検出しています。黄色の枠で囲まれたYFP蛍光チャネルにおいて、この共食い個体のサブポピュレーションは、マトリックス産生個体のサブポピュレーションと協調的に分化することが報告されています。左下のパネルでは、別の単一ラベル付き株を用いて、CFP蛍光チャネルでマトリックス産生個体のサブポピュレーションを検出しています。

右下のパネルにおいて、青色で囲まれた二重標識株の結果では、緑色で囲まれたYFPとCFPの両方を発現する蛍光細胞の単一のサブポピュレーションが示されました。これら2つのレポーターが同時に発現していることは、同一のサブポピュレーションにおいて、両方の細胞分化経路が協調的に活性化されていることを示しています。このビデオを視聴することで、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーなどの細胞集団解析を用いて、微生物バイオフィルムを構成する個別の細胞サブポピュレーションを可視化および定量化する方法について、十分に理解できたはずです。