蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

この実験の目的は、植物オルガネラの形態的および機能的な完全性を担う遺伝子を特定することです。まず、オルガネラ蛍光マーカーを保持するシロイヌナズナの種子に化学変異剤としてエチルメタンスルホナートを添加します。次に、第一世代の変異株（M1）の個別の植物から種子を回収し、次世代の変異株（M2）のラインを育成します。

次に、変異誘発したElianaの種子を共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察し、器官の異常表現型を特定します。最終ステップとして、第3世代の変異体を作成し、変異表現型の存在を確認します。最終的に、次世代シーケンシングツールを用いて、劣性変異のマッピングを行うことができます。

変異遺伝子の位置が特定された後、野生型遺伝子による形質転換を行うことで、異常なオルガネラの表現型を回復させることができます。この手法は、植物オルガネラの形態的および機能的な完全性の維持に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。Atil methanesおよびスルホン酸処理をatop sta種子に施すと、ゲノム内でシトシンのタイミング変化が誘導され、結果としてシトシンgwanからtimingへの変化が生じます。

変異の導入。本プロトコルにおいて、M2個体内で最適な変異率を確保するために、EMS処理は重要なステップとなります。まず、適切なオルガネラ蛍光マーカーを導入済みの野生型Columbia ecotypeのArabidopsis種子を用意します。

0.8 g（約40,000粒）の種子を50 mLファルコンチューブに移します。次に、25 mLの蒸留水と0.2%エチルメタンスルホン酸を添加します。この混合物を変異誘発用ミキサーを用いて低速で16時間インキュベートします。インキュベーション後、液体を吸引し、1 M水酸化ナトリウムを含むフラスコに廃棄します。

EMSを不活化させるため、種子が入ったFalconチューブに25 millilitersの水を加えます。チューブを閉め、5回反転させて種子を洗浄します。すべての種子が沈殿した後、水を吸引し、1 molar水酸化ナトリウムフラスコに廃棄してください。

この洗浄工程を最大10回繰り返した後、最終洗浄で種子を少量の水に浸します。次に、10% bleachを25 milliliters加え、30秒間激しく振って種子の滅菌を行います。種子が底に沈殿したら、bleachを捨て、25 millilitersの滅菌水で洗浄します。

滅菌水を除去した後、70%エタノールを25 milliliters加えます。チューブを30秒間振盪し、種子が底に沈降するまで待ちます。エタノールを捨て、25 millilitersの滅菌水で洗浄します。

滅菌水での洗浄を2回繰り返します。次に、3 mmのフィルターペーパーを入れたプラスチック製ペトリ皿に種子を注ぎます。種子を4 °Cで2日間インキュベートした後、フード内で乾燥させます。

種子を、ゲル剤としてフィターゲルを含む1/2 MS培地（Magi and scoog medium）が入った150 mmのペトリ皿に、1枚あたり約250〜300粒の割合で播種します。M1世代の種子をプレート上で2週間育成します。その後、苗を土壌に移植し、引き続き生育させます。

30日から45日後、植物は成熟期に達し、リーク（漏出）が明確に確認できるようになります。この時点で、個々のM1植物からM2種子を回収し、1000系統の独立したM2ラインを作製します。共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡で苗を観察するため、各M2ラインから60粒の種子を、半分の培地を入れたプラスチック製ペトリ皿で7日から10日間育成します。

Phytagelを含むMoreishおよびscoog培地を用いて、同一プレート上にEMS未処理の対照群として5つの苗を育成します。苗が成長したら、5〜10本のcotyledon（子葉）を、ABACシール側を顕微鏡の40倍対物レンズに向けてスライドガラス上に固定し、カバーガラスで覆います。蛍光顕微鏡下で、皮層から髄まで各oleinを観察し、オルガネラマーカーの細胞内分布に変化があるかを確認します。陽性個体を土壌に移植し、上述と同様に苗を育成させ、M3世代で変異表現型が固定していることを確認します。

書面によるプロトコルに記載されている通り、目的のオルガネラ蛍光マーカーを含む野生型ゲノムへ少なくとも3回の戻し交雑を行い、混入した背景変異を除去します。マッピングを開始するには、Qiagen DNeasy Plant Mini Kitを用いて、ホモ接合型変異体Columbia DNAであるM3から約3 µgのゲノムDNAを抽出します。このDNAをIllumina Genome Analyzer 2 14シーケンシングに提出してください。

次のステップは、zago変異体ColombiaとLas Bergerを交配させ、自己受粉後の後代において組換えが起こりうる個体を生成することです。得られた後代（F2世代）は、最終的に、変異の原因となる目的遺伝子を含むマッピング集団として機能します。この集団のゲノムDNAと野生型植物のゲノムDNAを比較することで、ゲノム内における変異箇所の特定が可能になります。

F2個体を育成した後、異常な表現型を示すF2個体を70〜100個体、および野生型表現型を示すF2個体を同数集め、ホールパンチを用いて各個体から葉ディスクを採取する。葉ディスクは、同齢の葉から採取すること。DNA量を均一にするため、サンプルは個別に、またはグループに分けてゲノム抽出処理を行うことができる。

この場合、各eend orphチューブにつき5〜10個のサンプルを回収することが可能であり、これによりゲノムDNAを抽出する必要があるチューブの数を減らすことができます。MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kitを使用してゲノムDNAを抽出してください。その後、各サンプルから得られたゲノムDNAをNanoDropで定量できます。

次に、変異型と野生型のサンプルを分けて、各サンプルから等量のDNAを合わせて合計300 nanogramsになるように混合し、標識反応の準備をします。まず、2.5 x random primer solutionを60 microlitersと、水を42 microliters加えます。DNAを95 degrees Celsius以上で5～10分間変性させた後、サンプルを氷上で急冷してDNAを変性させます。10 X DN tpsを15 microliters加えます。

biotin DCTPおよび3 µLのGlen polymeraseを加えて混合します。サンプルを25 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、3 Mの酢酸ナトリウム15 µLと、冷却した100%エタノール400 µLを加えます。混合サンプルを20,500 ×gで15分間遠心分離した後、-80 °Cで1時間インキュベートします。再度遠心分離を行い、ペレットを冷却した75%エタノール500 µLで洗浄します。

DNAペレットを37 °Cで10分間乾燥させます。ペレットを100 µLの水で再懸濁し、そのうち5 µLを用いてゲル電気泳動で収量と品質を確認します。野生型F2植物のプールおよび変異体F2植物のプールから得られたランダム標識反応産物を、1%アガロースゲルにアプライしました。

最終ステップとして、野生型および変異体のラベル化反応液 95 µL を、gene chip arabidopsis ath one ゲノムアレイハイブリダイゼーションに供します。スキャナーで読み取った後、得られたドット CL ファイルを専用ソフトウェアを用いて解析します。ソフトウェアをインストールし、プログラムを起動して、書面の手順書にある bioconductor 文字列を貼り付けてください。

次にリターンキーを押すと、array, genotyping and mappingのウェブサイトから標準的なBIOCONDUCTORパッケージがインストールされます。テキストに記載されているファイルをダウンロードし、デスクトップ上の新しいフォルダに解凍して保存します。ジーンチップ実験で得られたデータを、野生型C、L、および変異型Cとして保持します。次に、野生型Cと変異型Cのジーンチップデータをそのフォルダにコピーします。

次に、PCでRを開きます。[ファイル]をクリックし、[ディレクトリの変更]をクリックします。ファイルが保存されているフォルダを選択し、[ワークスペースの読み込み]をクリックして、A1V5 R dataを選択します。メモ帳でread C do Rを開き、全文をRにコピーします。Macの場合は、[メニュー]をクリックし、[作業ディレクトリの変更]をクリックします。

ファイルが含まれているフォルダーを選択します。[workspace load workspace file] をクリックし、ATH one V five R data を選択します。同様に、テキストエディタを使用して SFP R と MAP R の両方を開き、そのテキストをコンソールの R ウィンドウにコピーします。

Arabidopsis information resource（TAIR）で遺伝子を検索するようメッセージが表示されます。テキスト内にあるリンクをコピーしてインターネットブラウザに貼り付けてください。ウィンドウが表示され、ファイルを「開く」か「保存」かを確認するメッセージが出ます。

「保存」を選択します。ファイル名を入力し、拡張子を付加してください。x lsを実行します。

次に、「保存」をクリックします。ここに期待される典型的な結果を示します。ジーンチップ Arabidopsis H1 ゲノムアレイから得られたデータを解析した後、この図はジーンチップ Arabidopsis H1 ゲノムハイブリダイゼーションを用いた Columbia 0 変異のマッピング例を表しており、水平線は検出閾値を示しています。

この例の変異は第1染色質上に位置しており、垂直線で区切られています。dot XLSファイルを開き、マッピング領域内にある変異体の座標を確認してください。変異体ゲノムのアセンブルされたIlluminaリードにおいて、一塩基多型の中から特定のEMS遷移を特定します。

本プロトコルで説明する手法を習得すれば、従来のマッピング法と比較して、より短い期間で遺伝子のマッピングを行うことが可能です。