線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた

このビデオでは、C. elegansの成長と体サイズを調節する遺伝子を特定するための手順を実演します。RNA干渉（RNAi）を用いて候補遺伝子を不活性化させるため、まず標的となる遺伝子を標的とする二本鎖RNAを発現する細菌を含むプレートを調製します。その後、L4期の雌雄同体幼虫をRNAiプレートに転移させます。

若成虫段階に達した後、産卵のために新しいRNAIプレートに移します。数時間後、成虫を取り除くことで、同期させた胚の集団を得ます。目的の発育段階に達したところで、子孫を回収し、スライドガラスに封入します。

最後に、線虫の顕微鏡画像を撮影します。画像の解析により、遺伝子の不活性化によって引き起こされる体サイズの変化が示されます。この手法はTGF betaシグナル伝達経路の調節因子の特定に使用できますが、インスリンシグナル伝達経路など、C. elegansの胚発生後の発達を調節する他の経路にも適用可能です。

まず、標的遺伝子配列を、線虫RNAiで一般的に使用されるプラスミドであるベクター L 4 4 4 0 A にクローニングし、組換えプラスミドを細菌株 HT one 1 5 DE three に形質転換します。形質転換した細菌を、25 µg/mL のカナマイシンと 12.5 µg/mL のテトラサイクリンを含む LB 寒天培地で培養し、その後、単一のクローンをピックアップして今後の使用に備えます。

一方、空ベクター L 4 4 4 0 を細菌株 HT one 15 に形質転換します。実験のコントロールとして使用するため、形質転換した細菌を 100 µg/mL のアンピシリンを含む 1 mL の LB 液体培地で 37 °C で一晩培養します。

テトラサイクリンはRNAI効率を低下させるため添加しません。100 µg/mLのアンピシリンを含むLBブロスをさらに5 mL、オーバーナイト培養液に添加し、37 °Cでさらに4〜6時間インキュベートします。培養が完了したら、適切なクローン名でラベル付けしたRNAI用ウォームプレートに、実験群または対照群の細菌を0.5 mLずつ播種します。

各条件につき、少なくとも2枚のプレートを準備してください。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、

標的遺伝子配列を含む、または含まないRNAiを発現する細菌のローンを形成しておきます。動物はこれらの細菌を餌として利用します。RNAi給餌プレートの準備が整ったら、白金線の先端を火炎滅菌します。

次に、白金線を使い、第4段階幼虫（L4）の C. elegans ヘルマフロダイトを各RNAiプレートに6から10匹ずつ移します。ヘルマフロダイトを20 °Cで一晩培養します。翌日には、個体は若齢成虫になります。

それらを、適切にラベル付けされ準備された新しいRNAIプレートに移します。成虫に産卵させるため、プレートを20 °Cで4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、次世代を同期させるために、プレートからすべての成虫を取り除きます。

成虫を除去した後、時間を計測し始めます。これを0時とします。プレートを20 °Cでインキュベートし、動物を目的の発達段階まで成長させます。

ここでは、表現型解析のために若成体を選択します。通常どおりの速度で成長するノックダウン個体の場合、72時間の培養が必要です。遺伝子によって動物の成長への影響が異なるため、培養時間を調整する必要があることに留意してください。

RNAiによって個体の成長速度に差が生じた場合、若成体は、L4期から24時間以内で、VUL（陰門周辺組織）の発達が完了し、子宮内に2〜6個の胚が確認できる個体として識別します（ここに示す通り）。その他の発達段階を識別するには、生殖腺およびVULの発達状況を指標としてください。個体が適切な段階まで成長したら、RNAi処理した線虫の身体サイズの表現型をスコアするための準備を行います。

次に、ここに示すように、厚さ1 mmのガラス標本スライドに色付きのラベルテープを2層貼ります。このガラススライドを2枚作成してください。その後、テープを貼った2枚のスライドの間に新しいガラススライドを挟み、水で溶解した2% Agrosを1滴滴下します。

新しいガラススライドの中央に、2枚目のガラススライドを上から押し当て、薄いアガロースパッドを作成します。アガロースが凝固したら、上のガラスを取り除きます。これで、アガロースパッド付きのガラススライドに線虫をロードする準備が整いました。

スライドにクローンの名前を記入します。arosパッドに25 millimolarのアジ化ナトリウムを10 µL加えます。次に、前述と同様に白金線を用いて、30から40匹の個体をアジ化ナトリウム溶液に移します。

個体を固定するため、上からカバーガラスを被せます。この操作を、リコンビナントおよび空のL 4 4 4 0を搭載しRNAi処理を施した個体の両方に行います。次に、対物レンズ2.5xの実体顕微鏡下にマイクロメーターのスライドガラスを設置します。

Q Captureまたは同様のソフトウェアを使用して、マイクロメーター定規の画像をキャプチャして保存します。次に、線虫を顕微鏡下に配置し、画像をキャプチャします。まず体長を測定するため、Image Proソフトウェアでマイクロメーター定規の画像を開きます。

次に「measure」をクリックし、「calibration」を選択します。続いて、「calibrate the active image」を選択した状態で「spatial Calibration wizard」を選択します。「next」をクリックしてください。

キャリブレーションの名前を入力し、空間参照単位がミクロンに設定されていることを確認します。次に、「参照キャリブレーションを作成する」ボタンにチェックを入れ、「次へ」をクリックします。「参照線を引く」をクリックしてください。

リファレンススケールバーが表示されます。スケールバーを移動させ、マイクロメーターの両端に合わせます。その後、そのリファレンスが1000ユニットであることを指定します。

「OK」をクリックします。次に「次へ」と「完了」をクリックします。ソフトウェアのキャリブレーションが完了したら、線虫の画像を開きます。

次に、「measure」メニューから「calibration」を選択し、「select spatial」をクリックします。プルダウンメニューから、マイクロメーター校正用に作成したファイル名を選択してください。その後、「measure」メニューから、開いたウィンドウにある「measurements」を選択します。

フリードローツールを選択し、コンピューターマウスを使用して、動物の体の中心に沿って頭から尾まで線を引きます。長さがウィンドウに表示されます。視野内のすべての動物に対してこの操作を繰り返します。

長さの測定結果をMicrosoft Excelファイルまたはその他の適切な統計ソフトウェアにエクスポートします。各サンプルの平均値と標準偏差を算出してデータを分析します。その後、Studentのt検定を用いて各群の結果を比較します。

TGFβ（トランスフォーミング成長因子β）スーパーファミリータンパク質であるDBL1は、TGFβパスウェイの活性化に必要です。シグナル活性化に反応して、細胞内のSmadシグナル伝達物質が核へ移行し、遺伝子転写を開始します。TGFβパスウェイが阻害されている個体では、野生型動物よりも体長が短くなるなど、体サイズが小さくなることが観察されます。

したがって、C. elegansを用いてスクリーニングを行います。体サイズ変異体を用いることで、TGF βシグナル伝達経路の構成要素および修飾因子の特定が可能となり、摂食によるRNAiの有効性を検証して体サイズ変異体を同定できます。RNAiを用いて、C. elegansの4つの異なる系統において、DBL 1経路の構成要素であるSMA 3およびSMA 6をノックダウンしました。

テストに使用したC. elegans系統には、RNAi過敏性系統であるLin-15 BおよびRF3の2系統に加え、標準的な野生型系統であるN2と、ここで示すようにRNAi感受性がN2と同等であるLIN-36系統が含まれていました。SMA-3またはSMA-6の発現を阻害したところ、Lin-36におけるSMA-6 RNAiを除き、動物は対照群と比較して体長が有意に短くなりました。RF3の背景における結果です。

RNAi処理後の若年成虫の背景体長は、ベクターのみの場合の84〜95%であった。A one Lin 15 B背景におけるRNAi処理後の若年成虫の体長は、対照群の動物の68〜86%であった。しかし、A one lin 15 B系統は産仔数が少ない。

このため、これらは大規模スクリーニングには適していません。したがって、これらの手法にはRF three株の使用が推奨されます。このビデオを視聴することで、RNAi干渉法を用いて成長と体サイズを調節する遺伝子を特定する方法について、十分に理解できるはずです。