電子鼻を使用した果実の揮発性の分析

本手順の全体的な目的は、果物に含まれる揮発性化合物の迅速な分析を行うことです。まず果実組織を裁断して均質化し、次いで液体試料の上部の気相を電子鼻で分析することでこれを達成します。

電子鼻による分析の後、データはエクスポートされ、変換されます。この手順の最終ステップは、グラフィカルインターフェースを用いてcovasインデックスウィンドウを特定し、複数のピークを単一のcovasインデックスラベルの下に統合することです。最終的に、電子鼻で測定された果実 follicle の含有量の違いが、果実の品種、成熟度、保存などの実験的処理に関連していることが示されます。

従来のガスクロマトグラフィーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、果物中の揮発性化合物をより迅速に分析できることです。この分析を行う際、分析物の保持時間にわずかな変動が生じることがあります。ピークアライメントのプロセスを慎重に検討しなければ、データの誤認につながる可能性があります。

目的の成熟段階で果実を収穫した後、水道水で洗浄します。汚れや埃を除去し、分析に用いる果実を選別します。外観および内部に欠陥がなく、大きさが均一な果実に基づき、揮発性成分のサンプリングに使用するため、果実を縦方向にくさび形に切断します。

該当する場合、種皮、種子腔組織、または果核を除去します。組織の選択は実験全体を通して一貫していなければならず、単一の果実内における変動を考慮する必要があります。例えば、赤道部の花端側と茎端側の両方から均等にサンプルを採取する必要があります。

選択した果実組織をまとめ、ランダム化するために混ぜ合わせた後、200 gを市販のブレンダーに計り取ります。飽和塩化カルシウム溶液を200 mL加えます。塩化カルシウムは、果肉の切断およびホモジナイズ後に起こりうる酵素活性を抑制することを目的として添加します。

次に、100 millimolarの2-メチルブチルイソアテのメタノール溶液を50 µL加えます。この溶液は、ホモジナイズ工程における揮発性化合物の消失を監視するための内部標準として添加します。続いて、ラボ用ブレンダーを用いて、混合物を18,000 RPMで30秒間ホモジナイズします。

その後、直ちにガラス瓶に注ぎ、テフロン蓋で密閉します。すべてのサンプルの調製が完了するまで、ホモジネートを瓶に入れて保持してください。泡のないジュースを5 mLずつ、20 mLの褐色ガラスバイアルに分注します。各サンプルにつき、少なくとも3本のバイアルを調製してください。

テクニカルレプリケートとして使用します。テフロンシリコンセプタム付きのステンレス製スクリューキャップでバイアルを密閉します。この時点で、サンプルをすぐに分析するか、液体窒素で急冷し、後の分析のために超低温で保存します。

適切な分析メソッドをXenosにロードします。書面によるプロトコルに従ってパラメータを入力してください。非コアリングチップを備えたステンレス製ニードルをXenosのインレットに接続します。

ベースラインが安定し、200カウントを超えるピークが検出されなくなるまで、周囲空気でシステム内を数回パージします。圧力を逃がすため、直鎖状acas溶液が入ったバイアルのセプタムにニードルを刺し、装置のチューニング準備を行います。その後、装置の導入部に接続されたニードルをセプタムに刺入します。

ヘッドスペースサンプリングを開始してチューニングを行います。チューニング結果は、装置ソフトウェアによって、参照ピークの保持時間を時間単位からcovas指数またはKI単位に変換するために使用されます。その結果、システムのチューニング後、保持時間はKI単位で報告されます。

サンプルバイアルのセプタムにニードルを挿入し、サンプルを30分間平衡化した後、サンプル分析を開始します。直鎖状acas溶液で行った手順と同様に操作してください。再生ボタンをクリックしてヘッドスペースサンプリングを手動で開始すると、ポンプが作動し、サンプルの上部に存在する蒸気が吸引されます。

分析の終了時にクロマトグラムが画面に表示され、センサーを洗浄するために自動的に150 °Cで10秒間加熱されます。システムステータスボックスが再び緑色になると、装置は別のサンプルの分析が可能な状態になります。ベースラインの安定化と適切なシステム洗浄を確実にするため、各サンプルの間に少なくとも1回のエアブランクを実行してください。

サンプルごとに少なくとも3つのテクニカルレプリケートおよびバイアルブランクを分析します。Menseソフトウェアのlog stored data機能を用いて、データ取得後にデータをMicrosoft Excelファイルにエクスポートします。データのエクスポート後、変数とレプリケートのラベルを含む列を追加します。

装置ソフトウェアからエクスポートされたデータ形式は、当研究室で作成したPython 0.6スクリプトを用いることで、操作しやすい形式に変換できます。入力データのソースファイル名とシート名、および出力先の希望ファイル名は、スクリプト内で直接編集します。このスクリプトは、すべてのサンプルにわたって一意のkiを特定することで、データの操作および解析を容易にします。

データは、行にサンプル情報、列に固有のKISが配置されるように並べ替えられ、各セルは対応するピーク面積を表します。サンプル内で特定のKI値のピークが検出されなかった場合、対応するセルは空のままになります。次に、このラボインポートによって生成された2つ目のスクリプトを使用して、前のステップで編集したファイルのデータを読み込みます。

解析は、各KI値が検出された回数を視認および分析することに基づいています。したがって、プログラムはKIヒット数の棒グラフを表示します。各KI値について、サンプルの特定のサブセットのKヒットを評価し、テクニカルレプリケートの各グループをまとめて分析してください。

そのためには、対応するチェックボックスをオンまたはオフにして、各処理または変数を個別に分析してください。グラフィカルインターフェースを使用して各KIウィンドウの幅を特定した後、対応するクロマトグラムをいくつかランダムに選択します。menseソフトウェアを用いて、テクニカルリプリケート間のピークの重なりを評価します。

KIウィンドウを個別に設定した後、グラフィカルインターフェースのマージ機能を使用して、ウィンドウ内にあるKISを、最も個体数の多いkiにマージします。まず、マージボタンをクリックして機能を有効にし、ウィンドウ中央にある最も個体数の多いkiに対応するバーを左クリックして選択します。バーを選択すると色が緑色に変わります。ウィンドウ内にあるKISを選択したkiにマージするには、対応するバーを右クリックします。

これにより、バーが赤色に変わり、対応する長さの青色のバーが中央のkiの上に積み上げられます。選択したすべてのkiが適切な中央のkiに統合されたら、再度統合ボタンをクリックして変更を確定させてください。操作に誤りがあった場合に備え、確定させると統合ボタンが黄色に変わります。

解除ボタンを使用して、結合を解除することも可能です。グラフィカルインターフェースにある解除ボタンをクリックしてください。次に、結合を解除したい赤色のバーを右クリックします。

バーの色が赤から青に変わります。「un merge」ボタンをもう一度クリックして、変更を確定させます。1つのサンプル内の2つのピークを誤って1つのKI値にマージしようとした場合は、エラーメッセージが表示されます。

すべての統合操作が完了し、統計解析に進む前にファイルを保存した後、空気およびバイアルブランクのクロマトグラムを解析し、汚染の可能性を監視します。ピークとブランクの保持時間が特定されたら、空気および/またはバイアルブランクで検出されたピーク面積を、サンプル中に存在するピーク面積から差し引きます。電子鼻を用いることで、異なる成熟段階で収穫されたメロン果実の間で、揮発性プロファイルに差異があることを検出することができました。

ここに、成熟初期の果実と完全熟成した果実のクロマトグラムの例を示します。これにより、多くのピークにおけるピーク面積の差が明らかになります。全サンプルにわたって 20 K のウィンドウが特定されました。分散分析の結果、これらの異なる kis のうち、電子鼻によって検出された 14 個のピークの豊富さが 2 つの成熟段階間で有意に異なることが示されました。ここでは、これらの kis それぞれについて、成熟初期の果実のピーク豊富さを緑色で、完全熟成した果実のピーク豊富さをオレンジ色でプロットしています。

この手順を完了した後、電子ノーズの開発に伴い、ガスクロマトグラフィー質量分析法などの他の手法を用いて、個々のピークに対応する成分を特定させることができます。この技術は迅速な分析ツールとなり、植物病理学、植物生理学、収穫後生物学、および食品科学の分野の研究者が、成熟度、品種、または貯蔵期間に応じた果実中の揮発性成分の変化を調査することを可能にします。このビデオを視聴することで、電子ノーズを用いて揮発性化合物を迅速に分析する方法と、当社のグラフィカルインターフェースを使用してピークアライメントを行う方法について十分な理解が得られるはずです。