脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

本手順の全体的な目的は、乳幼児期ストレスによるDNAメチル化および遺伝子発現の変化を研究することです。これは、まず新生仔マウスを母子分離にさらし、乳幼児期ストレスを誘発させ、次に、関心領域である脳のPVNをin locoマイクロダイセクションにより採取し、単一の組織パンチからDNAとRNAを同時に単離することによって達成されます。

次に、得られたDNAを亜硫酸塩処理し、目的領域をビスルファイトPCRで増幅させます。これをその後、ベクターにライゲーションし、細菌に形質転換させます。形質転換の成否は、マーカーの発現およびPCRフラグメントのサイズによって確認します。

最後に、メチル化状態を評価するためにバイサルファイトシーケンシングを用います。このワークフローの主な利点は、環境刺激に応答したエピジェネティックなプログラミングを簡便に解析できることです。この手法により、幼少期の逆境によるエピジェネティックなプログラミングに関する知見を得ることができます。

本手法は他のシステムにも適用可能です。メチル化と遺伝子発現が高度に組織特異的な環境で分析される場合や、組織の利用可能性が限られている場合に有効です。早期生命ストレスを誘発するため、妊娠日数を管理したC 57 black six Nの母マウスの子マウスに対して、母子分離を実施します。

生後1日から10日まで、各リターを1日3時間、加熱された清潔なケージに移します。ストレスを与えないコントロール群の幼マウスはそのままにしておきます。この3時間の分離を除き、すべてのリターは生後21日の離乳まで母親と一緒に飼育します。その後、幼マウスを標準的な飼育条件下で、1ケージあたり3〜5匹の性別を合わせたグループで飼育します。脳組織の回収を開始するため、マウスの脳を頭蓋骨から取り出し、直ちにドライアイスで急冷し、-80°Cで保存します。

組織パンチを採取する準備ができたら、-80°Cのフリーザーから脳を取り出し、ドライアイスの上に置きます。まず、脳を吻側から尾側に向かって10 µmの厚さで冠状断に凍結切片作成します。切片をSuperFrostガラススライドにマウントし、クリスタルバイオレット染色のために乾燥させます。

追加の切片を作成し、in situ ハイブリダイゼーションなどのさらなる解析のために-20°Cで保存することができます。パンチ準備が整ったら、目的の脳構造を特定するためにスライドをクリスタルバイオレットで染色します。次に、パンチ針を用い、in loco マイクロダイセクションにより目的領域から0.8 mmのパンチを採取します。

パンチ試料は−80°Cで保存してください。遺伝子発現およびメチル化は組織特異性が非常に高いため、マイクロパンチを標準化された方法で実施することが極めて重要です。ピペットを用いて、400 µLのチオシアネート緩液中でパンチ試料を均質化し、室温でボルテックスしてください。

次に、得られた溶出液を29ゲージの注射器に通します。これを数回繰り返し、組織片が見えなくなるまで行います。その後、溶出液を等分に分割します。

一つはRNAの処理用で、こちらを先に行う必要があります。もう一つはDNAの処理用で、RNAの処理が終わるまで室温で保存可能です。RNA精製のために、1/10量の酢酸ナトリウム、1量のAqua Phenol、および1/2量のクロロホルム:イソアミルアルコール（24:1）を加え、ボルテックスします。各試薬の添加後に混合液を激しく攪拌し、最終的な混合液を氷上で10分間インキュベートします。その後、混合液を遠心分離します。

水相を回収し、同量の70% ethanolを加えます。RNAスピンカラムキットを用い、カラム上でDNA消化を行い、洗浄後、25 µLの水でRNAを溶出させます。

次に、RNase消化の工程を追加し、溶出バッファーと溶出カラムを使用前に70 °Cに温めるよう変更したキットプロトコルを用いて、DNAを精製します。カラムについては、70 °Cで10分間温めれば十分です。最後に、分光光度計を用いてDNAおよびRNAの濃度を測定します。

典型的なPVNパンチからは、約600 nanogramsのDNAと約400 nanogramsのRNAが得られます。そのうち、約100 nanogramsのRNAは、バイサルファイト処理による増幅前の定量PCRによる遺伝子発現解析用に別途確保します。単離したDNA 200 nanogramsを市販のキットで処理し、メチル化領域からDNAを増幅させます。バイサルファイト変換後のDNA用に特異的に設計されたプライマーを注文してください。バイサルファイトPCRにおける最適なプライマー設計は不可欠です。なぜなら、PCRアンプリコンの品質と特異性が、以降のステップの成否を決定するためです。

プライマーが届いたら、予備実験を行って最適温度とアニーリング温度を決定します。25 µLのPCR混合液1反応あたり、テンプレートとして2 µLの重亜硫酸塩処理済みDNAを使用してください。

混合液を、95 °Cでの6分間の変性から始め、45〜50回の増幅サイクルを行い、最後に72 °Cで5分間の伸長反応させて増幅します。PCR産物7 µLをアガロースゲル電気泳動で解析し、アンプリコンのサイズを確認します。残りのPCR産物は、市販のPCR精製キットを用いて、次工程のライゲーションのために精製します。

目的外のPCR産物が得られた場合は、ゲル精製を用いて本プロトコルの目的産物を単離してください。ここでは市販のクローニングキットを使用します。クローニング効率は、インサートに大きく依存します。

したがって、組換えクローンの得られる数が繰り返し少なくなった場合は、別のクローニングベクターを試してください。ベクター 1 µL と精製済み PCR 産物 3 µL を用いて、10 µL のライゲーション反応液を調製します。ピペッティングにより反応液を混合し、4 °C で一晩インキュベートした後、翌日に処理を行います。

古典的なエタノール沈殿によりライゲーション反応液を精製し、得られた産物を細菌に形質転換させます。パルス電撃法の直後に、あらかじめ温めておいたSOB培地を1 mL直接加え、形質転換した細菌を反応チューブに移します。37 °Cで1時間細菌を回復させた後、各懸濁液 100 µLをIPTGを含むLBアンピシリンプレートに塗布します。

プレートを一晩インキュベートし、コロニーをピックアップ可能な状態にします。96ウェルプレートを用いて25 µLのコロニーPCR反応系を構築し、各反応に3 µLの2.5 mM塩化マグネシウムを加えます。白色のポジティブクローンをピペットチップでピックアップし、軽く浸すことでPCRミックスに転移させます。

まず、4分間の融解サイクルでPCRを開始します。続いて、アニーリング温度を56 °Cとして10回の増幅サイクルを行います。これらのサイクルの各ステップは30秒間です。

次に、アニーリング温度を48 °Cに下げ、さらに30サイクルの増幅を行います。最後に、5分間の伸長サイクルで終了します。各産物を5 µLずつアガロースゲルに電気泳動し、適切なサイズのインサートが含まれている反応を特定します。

市販のキットを使用して目的のPCR産物を精製し、BigDye Terminatorサイクルシーケンシングによる解析が可能な状態にします。96ウェルプレートの各ウェルに、3 µLのBigDye反応マスターミックスを分注し、続いて2 µLの精製済みコロニーPCR産物を加えます。サーモサイクラーを用いて、96 °Cで1分間の初期変性を行い、その後、96 °Cで10秒、50 °Cで5秒、60 °Cで4分間の工程を35サイクル繰り返して反応させます。

bisulfite反応の終了後、bisulfite精製プレートを用いて反応液を精製します。配列を得た後、オンラインのbisulfiteアナライザーまたはBISM-Aツールを用いて解析し、調査対象となるDNA領域のメチル化パターンを導き出すことで、人生早期ストレス（ELS）がavpの発現およびメチル化状態に与える影響についての知見を得ます。C57BL/6マウスを記載のプロトコルに従って処理し、室傍核および視上核をパンチで採取してDNAを単離しました。DNAを重亜硫酸塩処理し、avpエンハンサー特異的なプライマーを用いて増幅させ、PCR産物をクローニングし、マウス1匹あたり少なくとも20個の組換えクローンをシーケンシングしました。

PCR産物を解析し、組織に含まれるPCRアンプリコン内のCPGのメチル化頻度を決定した。P-V-N-E-L-Sは、AVPエンハンサー上の4箇所で有意な低メチル化を誘導しており、これは生命早期の経験を通じてこの調節領域にエピジェネティックな標識が付与されることを示唆している。PVNとは対照的に、SONにおけるAVPエンハンサーのメチル化はELSの影響を受けておらず、エピジェネティックな影響の組織特異性が示された。対照動物において、CPG 10のDNAメチル化状態はAVP遺伝子発現と負の相関を示しており、AVP遺伝子発現の微調整におけるDNAメチル化の役割が示唆された。この手順の後、解析した組織における遺伝子発現の変化などの追加的な疑問を解決するために、単離したRNAを用いてUPCRなどの他の手法を容易に実施することができる。

このビデオを視聴することで、環境や経験依存的な刺激に対するDNAメチル化の変化を研究する方法について、十分に理解することができます。