モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

この手順の全体的な目標は、成体のゼブラフィッシュ脳の脳室にモルフオリゴヌクレオチドをマイクロインジェクションし、ラジオグリア細胞の遺伝子の活性をノックダウンすることです。これは、最初にゼブラフィッシュに麻酔をかけることによって達成されます。次に、頭蓋骨にスリットが作られ、とげのあるへこみ針を使用して視眼タムを覆います。

次に、モルフォ溶液を切開部位を通じて脳室液に注入します。最後に、注入効率と精度を蛍光顕微鏡で確認します。最終的には、成体ゼブラフィッシュの脳の放射状グリア細胞における目的遺伝子からのタンパク質産生の効率的かつ広範な阻害を、形態媒介遺伝子ノックダウンを通じて得ることができ、これは組織切片および免疫組織化学的染色によってアッセイすることができる。

トランスジェニックアプローチや電気操作ベースの送達方法などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、CVMIがラジオグリア細胞の全集団を標的とするのに時間がかかり、より効率的に標的化できることです。これらの調整可能な多くの遺伝子を同時にノックダウンすることができます。注射混合物を調製するには、まず500マイクロモルモルフォストック溶液を調製します。

PBSを10回の注射用として、9マイクロリットルの希釈または未希釈のモルフォ溶液と1マイクロリットルの蛍光トラッキング色素を組み合わせて、10マイクロリットルの注射用混合物を調製します。室温で保存してください。ニードルプラーを使用して、次のパラメーターに従ってガラス注入キャピラリーを調製します。

圧力源をオンにし、圧力設定を50PSIまたは3.5バールに調整します。マイクロインジェクターの設定を次のように調整します。保持圧力 20 PSI、射出圧力 10 PSI、周期値 2.5、100 ミリ秒。

ゲーティングの範囲。リングイルミネーターをオンにし、顕微鏡ステージ上にリングを配置します。キャピラリーホルダーを顕微鏡の隣の適切な位置に置きます。

ガラスキャピラリーをホルダーに挿入し、注入角度を45度に調整します。ファインドエンド鉗子を使用して、ガラスキャピラリーの先端をスナップオフし、オリフィスからの圧力出力を校正します。針の先端を魚の水に浸し、連続的な圧力パルスを適用することにより、気泡は最適な圧力またはオリフィスサイズを示す単一の列を形成するはずです。

ガラスキャピラリーに注入液をロードします。気泡を避けて、ガラスキャピラリーの先端と装填された注入液の間の空気を抜くために圧力をかけます。麻酔薬ミーブの0.1%茎溶液を調製した後、必要な数の魚を魚水の入った輸送容器に移します。

200ミリリットルの魚水と5ミリリットルのMISPストック溶液を混合して、麻酔薬の作業溶液を準備します。ペトリ皿の半分に麻酔薬を入れて注射に使用します。魚が動かなくなるまで麻酔薬で魚を孵化させます。

次に、ネットを使用して麻酔薬のペトリ皿に移します。切開を容易にするために、鉗子を使用して魚をそっと保持し、頭を少し下に傾けて向きを変えます。針に刺さった30ゲージの先端を使って、脳組織に損傷を与えるため、あまり深く貫通しないように頭蓋骨に小さなスリットを入れます。

魚を保持し続けながら、ガラス毛細血管の先端を切開部位に約半ミリメートル挿入し、脳組織との接触を避けながら、頭蓋に向けます。溶液を注入すると、すぐに分散するはずです。魚を新鮮な魚の水に移し、回復させます。

約30分後、魚に麻酔をかけ直し、蛍光顕微鏡で液体の広範な分布を探します。赤色蛍光に基づいています。魚を水槽に戻し、循環に戻します。

ここで見られるように、行動分析や組織標本の調製に使用するまでは、正確な注射は、注入された溶液が脳全体に分散し、心室表面に近い細胞を効率的に標的化することにつながります。しかし、ガラス毛細血管が突き刺さる注射では、脳組織は注射の時点で密な蛍光シグナルを持つことになります。そして、注入量が足りない場合、弱い蛍光シグナルが観察されます。

この図は、vivo morphosが心室表面内の数個の細胞径を貫通できるため、対照と比較して効率的に心室細胞を標的にできることを示しています。モルフォ。PCNAに対するmorphoの注入は、心室細胞の遺伝子発現を効率的にノックダウンします。これらの免疫蛍光画像では、A-B-R-D-Uパルスチェイス実験後のBRDUおよびQCD免疫染色により、アンチセンスモルフォーシスによるPCNAのノックダウンが新生児ニューロンの有意な減少につながることが示されており、CVMIを使用して内因性遺伝子をノックダウンし、その後機能的な結果を生じさせることができることが示唆されています。

したがって、その開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が魚の脳の成体Sの再生神経新生応答に関与する分子メカニズムを探求する道を開きました。