成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役

本手順の全体的な目的は、抗生物質との結合の有無によるナノ粒子の抗菌効果を高スループットでスクリーニングすることです。ここでは、この目的を達成するために、ポリミキシンBを結合させたテルル化カドミウム量子ドットの抗菌効果を試験します。まず、量子ドットをメルカプトプロピオン酸に溶解させます。

次に、量子ドットをポリミキシンBに結合させ、抗生物質をプレートに塗布した細菌を、抗生物質結合量子ドットと非結合量子ドットの両方で処理します。その後、サンプルの半分に440 nmの青色光を30分間照射して量子ドットにエキシトンと活性酸素種を生成させ、量子ドット処理が細菌の増殖と生存に及ぼす影響を評価します。吸光度を測定し、コロニー数をカウントします。得られたデータから、抗生物質結合テルル化カドミウム量子ドットを適用し、続いて照射を行うことで、テストした条件の中で最大の殺菌効果が得られることが示されました。

本手法は、カドミウムテルル量子ドットおよびそのpolyx in Bへの接合がE coliの増殖に及ぼす影響について知見を提供できますが、他の種類のナノ粒子や抗生物質をさまざまな細菌株に適用することにも利用可能です。一般的に、本手法に不慣れな者は、MPAが過剰になると量子ドットが凝集し、またtolineを少量でもピペットで出しすぎるとフィルターを破壊してしまうため、操作に苦労することがあります。

本日は、抗生物質を結合させたCdI₂量子ドットの抗菌効果を評価する方法について実演しますが、インジウムリン酸塩、硫酸亜鉛、および硫化亜鉛カドミウムなどの他の種類の量子ドットでも同様の方法を用いることができます。まず、ガラスバイアル内で15 µMのトルエン溶液としてカドミウムテルル（CdTe）量子ドットを調製します。吸光分光法を用いて光学密度（OD）を測定し、ピペットを用いてこのストック溶液200 µLをガラスバイアルに移します。

プラスチック製器具は使用しないでください。次に、800 µLのトルエン、1 mLの200 mMホウ酸緩衝液、および2 µLの11.5 M 3-メルカプトプロピオン酸（MPA）を加え、バイアルに蓋をして30〜60秒間激しく振盪します。振盪後、水相と有機溶媒相が自然に分離します。

水相は量子ドットと同色になります。タイリング層を避けるため、それを除去し、次に量子ドット相を取り出して清潔なバイアルに移します。可溶化した量子ドットを精製するには、それらを500 microliterの遠心フィルターに移します。

50 mMのBore 8バッファーを100 µL加え、3000 ×gで13分間遠心分離します。この洗浄工程を4回繰り返します。最終洗浄後、洗浄済みの量子ドットを500 µLのBoreバッファーに懸濁し、4 °Cで保存します。

これらは1〜2週間安定に保持されます。量子ドットの濃度を推定するため、吸光および発光スペクトルを測定します。この図は、UVランプ照射下のCdTe量子ドット、および水溶化前後の発光スペクトルを示しており、リガンド交換による光学特性の変化は無視できる程度であることがわかります。

プロトコルのこの部分は、モス、市販の量子ドット、金属粒子など、あらゆる負に帯電した水溶性ナノ粒子に適用可能です。本例では、抗生物質のポリミキシンB（PMB）を、モル比30:1で量子ドットに結合させます。PMBは正に帯電しており、結合させる必要なく自己組織化します。試薬としてPMBと水を用い、溶解させます。

濃度60 µMで調製します。1ウェルあたり0.3 mLの細菌を含む96ウェルプレートを4連重複で用いる場合、200 nMのコンジュゲート0.5 mLあれば十分です。これは、マイクロ遠心チューブに1 µMの量子ドット100 µLと50 mMのboreバッファーを加えることで調製できます。

次に、10xまたは60µMのPMB抗生物質水溶液を50µL、コンジュゲートチューブに加えます。コントロールチューブには水50µLを加えます。50mMのATEバッファーを用いて液量を0.5mLまで調整します。チューブをアルミホイルで遮光し、ローテーターで1時間回転させます。

凝集が発生した場合は、より低濃度の抗生物質を用いてコンジュゲーションを繰り返します。粒子が凝集しなくなるまで、濃度を徐々に上げて調整し、コンジュゲートを洗浄します。溶液を10,000分子量カットオフフィルターに通します。このフィルターはほとんどの抗生物質に有効ですが、タンパク質や抗体には使用できません。

最後に、吸光光度法、蛍光分光法、ゲル電気泳動、またはフーリエ変換赤外分光法を用いて、量子ドット1個あたりの抗生物質分子数を推定します。この図は、PMB接合前の量子ドットの典型的な吸光および放出スペクトルと、160モル等量のPMB添加後の放出スペクトルを示しています。

正方形で示されるPMB比と量子ドットの発光強度の関係、および三角形で示されるピーク波長の位置がここに示されています。PMB濃度が増加するにつれて、QDの発光強度は低下し、その結果、ピーク発光波長がシフトします。プロトコルの次の部分は、結合実験の2日前の夜に、抗生物質の半数最大抑制濃度（IC 50）および量子毒性を決定するために行われます。

E. coliの新鮮なコロニーを用いて、10 mLのLB培地に接種します。翌日、実験の1〜2時間前に、透明な96ウェルプレートの各ウェルを充填します。増殖培地を用いたアッセイプレートを、ここに示すように配置してください。

サンプルは3連でプレートし、抗生物質の濃度は、細菌の増殖をほとんど抑制しない濃度から、完全に死滅させる濃度までを網羅する十分に広い範囲に設定してください。接合実験で使用する濃度の量子ドットを含むウェルについても、同様に3連で含める必要があります。マルチチャンネルピペットを使用して、各適切なウェルに1〜50 µLの細菌培養液を分注します。

濃度は、特定の菌株の増殖速度によって異なるため、それに応じて調整する必要があります。増殖をモニターするために、プレートをプレートリーダーにセットし、600 nmで10分ごとに2時間測定するように設定します。すべての細胞のODが0.1から0.15に達した時点で、プレートリーダーからプレートを取り出し、記録を停止します。

次に、量子ドット含有PMBを適切なウェルに添加し、プレートの半分をアルミホイルで遮光して3連（triplicate）にします。その後、2.4 milliwattのLEDで作られたカスタム440 nanometerランプの下にプレートを30分間置き、プレートの照射側を露光させます。光照射後、プレートをプレートリーダーに入れ、増殖速度に応じて5〜12時間、10分ごとにOD 600を記録します。ソフトウェアを用いて、培養液の乾燥を防ぐため、可能な限り温度を32 degrees Celsius以下に保ってください。

選択した時点における増殖曲線を選択した対数濃度に対してプロットし、画面に表示されているヒル方程式を用いて抗生物質のIC 50を決定します。ここでHはヒル係数です。Y maxは増殖の最高点であり、Y minは同様にプラトー上にあることが望ましいゼロ点です。記録期間の終了時に、ウェルが透明であれば完全な細胞死を示しており、薬剤の濃度上昇に伴って細胞密度の勾配が現れているはずです。

細菌は、ここに示すようなS字型の増殖曲線を示すはずです。最大プラトーの位置は菌株によって大きく異なり、温度にも依存します。代表的な時点を選択し、その値を抗生物質の対数に対してプロットすることで、量子ドットを評価するためのIC 50を算出できます。

毒性生存率を量子ドット濃度の対数に対してプロットすることもできますが、使用した濃度で量子ドット単独により有意な細菌殺菌を達成することは稀です。量子ドット単独および抗生物質単独の毒性が決定されたら、同じプロトコルを適用して抗生物質の毒性を決定できます。結合した量子ドットを示しています。

以下はアッセイのレイアウト例です。コンジュゲートは濃度を上げて4連（quad duplicate）でテストすることに注意してください。また、細菌のみのコントロールストリップ、薬剤のみのストリップ、および量子ドットのみのサンプルウェルを含める必要があります。その後、OD 600の測定値を用いて増殖曲線を生成し、以前と同様にIC50値を算出します。

この図は、抗生物質単独と同等の毒性を持つコンジュゲートの例と、より高い毒性を持つコンジュゲートの例を示しています。各条件のコロニー形成単位（CFU）を決定するために、プレートカウントに使用する処理済みの96ウェルプレートから1つ以上のウェルを選択します。選択した各細菌サンプルを生理食塩水で段階希釈します。

この操作を行うには、適切なカラムに生理食塩水 180 µL を分注します。細菌懸濁液 20 µL を移し、生理食塩水 180 µL で希釈します。ピペットチップを交換して混合し、希釈した細菌懸濁液 20 µL を生理食塩水 180 µL に移します。

この工程を6回繰り返します。次に、最後の6段階の希釈液からそれぞれ10 µLを分注し、長方形のオーガープレートにスポットプレートします。長方形プレートには最大36スポットまでプレートすることが可能です。

プレートをベンチ上で15分間乾燥させ、その後37°Cで16時間インキュベートします。コロニー数を計測し、ミリリットルあたりのコロニー形成単位（CFU/mL）を算出します。コロニー数に希釈倍率を掛け、それを塗布量で割ることで、細菌の増殖に対する処理の効果を決定します。

E. coliの細胞密度をOD 600で測定しました。ここでは、薬剤濃度を0から細胞死に至るまで変化させた際の代表的な細菌増殖曲線を示しています。白抜きの記号はPMBのみを添加したもので、濃度を記載しています。

塗りつぶされたシンボルは照射なしのC-D-T-E-P-M-Bであり、半分塗りつぶされたシンボルは照射ありのC-D-T-E-P-M-Bである。照射はPMBのみのサンプルには影響しなかったため、視認性を高めるためにこれらの曲線は省略した。ここでは、光の影響を制御してIC 50値を決定するため、200分時点での増殖曲線の値をlog PMBに対してプロットし、この方程式にフィッティングさせた図を示す。

30分間の光照射を伴う、抗菌剤のみを用いた曲線を作成しました。この図は、CDTE qdsを用いた場合の、200分後における細菌の生存率とQD濃度の関係を示しています。光照射によるある程度の毒性が認められますが、IC 50値を決定するには不十分な値でした。

これは、接合実験に使用した濃度のCDTE単独における毒性が、異なる処理が細胞増殖に及ぼす影響を比較する上で無視できることを示しています。200分時点での増殖曲線の値をプロットし、ここに示すように前述の方程式に適合させました。C-D-T-E-P-M-B接合体は、PMB単独よりも毒性が高い結果となりました。対照的に、金ナノ粒子A-U-P-M-B接合体は、PMB単独と比較して毒性の増加を示しませんでした。これにより、各処理が細菌の生存に及ぼす影響を決定しました。

P-M-B-Q-D-P-M-BまたはQD単独で、放射線照射（30分間）の有無にかかわらず処理した96ウェルプレート内のE. coliについて、コロニー形成単位数を決定しました。その後、32 °Cで4時間インキュベートしました。各細菌サンプルの連続希釈を生理食塩水で行い、100倍から10⁷倍の希釈液10 µLをアガープレートに播種しました。プレートを37 °Cでインキュベートし、16時間後にコロニー数をカウントしました。

この例では、プレートのA列からC列はCDTEの濃度を上げて処理した細菌です。照射なしの共役体、およびD列からF列は、共役体の濃度を上げて処理した細菌です。30分間の照射とともに、行に沿って希釈系列が示されています。

データは、照射後の複合体が、照射なしの複合体と比較して細菌増殖に対してより高い抑制効果を持つことを示しています。Ca試薬は極めて毒性が強いため、この手順を行う際は、手袋、白衣、ゴーグルの着用などの予防策を必ず講じてください。このビデオを視聴することで、抗生物質への結合の有無によるナノ粒子の抗菌効果の高スループットスクリーニングの実施方法について、十分な理解が得られるはずです。