量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

この方法の全体的な目標は、蛍光免疫細胞化学情報と透過型電子顕微鏡からの超微細構造形態を1つの画像に組み合わせることにより、相関光顕微鏡と電子顕微鏡、またはCLEMデータを取得することです。この方法は、特定の対象タンパク質がどの細胞内構造に関連しているかなど、免疫細胞化学および病理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、同じ量子ドットナノ粒子プローブを使用して、標的タンパク質からの生顕微鏡信号と電子顕微鏡の構造局在の両方を取得することです。

テキストプロトコルに従ってヒト体性腫瘍組織を固定、埋め込み、切片化した後、2.0ミリリットルのアセトンが入った5ミリリットルのボトルに20センチメートルの透明な粘着テープを入れて切片接着剤溶液を調製し、10分間放置します。テープをはがし、ニッケルグリッドを溶液に浸してから、グリッドを取り外して風乾させます。乾いたら、グリッドのくすんだ面を使用して、非常に薄い部分を拾います。

選択した樹脂配合の正しいエッチング時間を設定することが重要です。この配合では 30 分が適切ですが、硬い配合または柔らかい配合の場合は再計算が必要になる場合があります。蒸留水に1ミリリットルの新鮮な飽和メタ過ヨウ酸ナトリウムエッチング溶液を調製し、溶液の液滴をきれいなラボフィルム表面に置きます。

完全に乾燥したグリッドに切片を載せ、室温で30分間インキュベートします。次に、グリッドを蒸留水滴に60秒間移して洗い流します。抗体と量子ドット、またはQD標識をクリーンなラボフィルム表面で実施するには、0.05モルのグリセンとPBSをピペットで滴下します。

液滴上にグリッドを置き、10分間インキュベートして切片上の残留アルデヒドをブロックします。アルデヒドブロックを除去するには、グリッドの端を短時間吸い取ります。次に、グリッドを1%の正常なヤギ血清(NGS)とPBS中の1%BSACの液滴に10分間置きます。

10マイクロリットルのNGSと100マイクロリットルのBSACを890マイクロリットルのPBSに加えて、1ミリリットルのブロッキング溶液を準備します。次に、切片を抗体希釈液の液滴上に10分間置いてコンディショニングします。次に、抗体希釈剤を用いて抗ソマトスタチンポリクローナル抗体を1:10に希釈し、溶液の液滴上にグリッドを配置します。

湿ったチャンバーで室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、グリッドの端をブロッティングして抗体試薬を取り出します。次に、抗体希釈剤を使用して、切片を2回、それぞれ5分間洗浄します。

二次抗体を1〜10に希釈し、液滴を調製した後、液滴上のグリッドを室温で1時間インキュベートします。その後、抗体溶液を取り出し、切片を2回洗浄します。ストレプトアビジン標識QDを1〜10に希釈し、暗所で室温で溶液の滴下でサンプルを1時間インキュベートします。

次に、抗体希釈剤を使用してグリッドを2回、各回5分間洗浄し、グリッドの端を拭き取ります。次に、グリッドを蒸留水で2分間洗浄してから、端を吸い取り乾燥します。免疫染色したグリッド切片をスライドガラス上の水滴に置き、ガラスカバースリップで覆います。

蛍光光学顕微鏡検査を行うには、以下の特性を持つフィルターキューブを挿入し、365ナノメートルのLED照明を使用します。免疫染色切片を免疫蛍光顕微鏡ステージに置きます。光学顕微鏡を使用して、標識パターン、非特異的標識のレベルを評価し、ネガティブコントロールが明確であることを確認します。

次に、グリッドバーに関連するROIを特定します。次に、フルカラーのデジタルカメラをFL自動カラーに設定し、ホワイトバランスを3、200 Kに設定します。カメラを0.45と1.00の間のガンマ設定で自動露出モードに設定し、画像の外観を最適化し、アナログゲインを1つのXに設定します。次に、画像に焦点を合わせ、ZEN Two Lightソフトウェアのグラフィカルインターフェイスで[スナップ]をクリックして、画像をフレームストアにキャプチャします。

圧縮やピクセル化を避けるために、画像をtfファイルとして保存します。グリッドバーやその他の重要な組織ランドマークに対するROIの位置を示すプリントを準備します。次に、グリッドをスライドから取り外し、蒸留水で洗い、端をそっと拭いて乾かします。

透過型電子顕微鏡法を実行するには、100キロボルトの加速電圧を使用して、グリッドを顕微鏡に移して検査します。グリッドの周りをナビゲートし、光学顕微鏡で見つけられたものとROIを見つけるために、約1、400倍の低倍率から始めます。個々のQDを70, 000倍以上の倍率で観察します。

それらは、中程度の電子密度を持つ不規則な結晶構造として現れます。次に、イメージングソフトウェアのグラフィカルインターフェイスでモノクロ1、392 x 1、040ピクセルセンサーを備えたデジタルカメラを使用して、カメラアイコンをクリックして画像を取得します。カメラアイコンをオフの位置に移動して、画像をフレームストアに保存します。

CLEMイメージングを実行するには、光学顕微鏡イメージングからのプリントを使用して、TEMによる対応するROIを特定します。Tissue アーキテクチャ機能は、セクション内のナビゲーションに役立ちます。TEMで対応するROIの画像をキャプチャします。

次に、CLEM画像を準備するには、TEM画像が正しい向きで、光学顕微鏡画像と同じサイズと解像度(この場合は1インチあたり300ピクセル)に拡大されていることを確認します。光学顕微鏡画像キャンバスのサイズを2倍に拡張します。次に、TEM画像をコピーして蛍光画像の横に貼り付けます。

Photoshop CS2 で蛍光オーバーレイを作成するには、長方形のマーキー ツールをクリックし、蛍光画像を選択して、そこから複製レイヤーを作成します。レイヤースタイルのブレンドオプションを透明度30〜40%に調整します。次に、移動ツールをクリックし、蛍光オーバーレイ層を対応するTEM画像上にドラッグして、画像を整列させます。

画像を整列させた後、画像をフラット化して最終的なオーバーレイを作成します。次に、長方形のマーキー ツールを使用して新しいオーバーレイ画像を選択し、新しいキャンバスにコピーします。最後に、画像を tf ファイルとして保存します。

この蛍光顕微鏡画像では、個々のソマトスタチノーマ腫瘍細胞には豊富な分泌顆粒が含まれており、ソマトスタチンホルモンが陽性で標識されています。核は暗い穴として現れ、低倍率では、細胞質に変動する強い粒状のオレンジ色の量子DNA蛍光が見られました。光学顕微鏡によって選択されたROIは、ここに示されているように、20倍光学顕微鏡画像を参照してTEMを使用して認識および画像化されました。

高倍率では、細胞は細胞質顆粒に明るい蛍光と強いQD標識を示します。この例のように、TEM画像に蛍光データを重ね合わせると、強力なポジティブラベリングが、小胞制限膜内に適度に電子密度の高い物質を含む顆粒に対応することが示唆されます。最後に、ここでより高い倍率で見られるように、適度に電子密度の高い顆粒は、強力なQDナノ結晶免疫標識を示しました。

一度マスターすれば、このテクニックは適切に実行すれば8時間で完了します。手順を試行する際は、グリッドをエッジのみで慎重に取り扱うことを忘れないでください。グリッドを拾い上げながらセクションに触れると、セクションがグリッドから外れる場合があります。

この手順に続いて、マルチプレックス免疫標識などの他の方法を実行して、目的のタンパク質が別のタンパク質と共局在しているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、病理学の分野の研究者が電子顕微鏡のためのアーカイブヒト組織プロセスにおけるタンパク質の局在を探求する道を開きました。このビデオを見れば、蛍光光学顕微鏡による免疫細胞化学情報と透過型電子顕微鏡による超構造を組み合わせる方法について、十分に理解できるはずです。

四酸化オスミウムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、保護具の着用、ドラフトでの作業、適切な廃棄物処理などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。