リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離

この手順の目的は、無細胞翻訳系で翻訳されたmRNAにおける主要な翻訳停止部位を特定し、その位置を明らかにすることです。まず、目的の遺伝子をT7転写プロモーターの制御下にクローニングします。次に、mRNAを転写し、精製します。

次に、mRNAと放射性アミノ酸の存在下でin vitro翻訳を行い、合成されたタンパク質と新生ポリペプチドを標識します。最後に、沈降速度遠心分離法を用いてポリソームを単離し、単離した新生鎖をゲル電気泳動で分離します。最終的に、Tristine SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより、長さの異なる新生ポリペプチドを示す結果が得られ、これにより目的のmRNA沿いのポーズサイトの存在が示されます。

マイクロコカル核保護アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、極めて簡便で迅速かつ効率的であり、特定の細胞内リスクシステムにおける任意のmRNAに沿った主要な翻訳後部位の決定および同定が可能であることです。この方法は、コドン使用量、tRNA量、またはmRNAの二次構造などの要因が翻訳速度にどのように影響するかなど、翻訳および翻訳共折畳み（コトランスレーショナル・フォールディング）分野における重要な疑問への回答に役立ちます。さらに本手法は、翻訳速度と共翻訳タンパク質折畳み経路における重要なステップとの関係についての理解を深めるのに寄与すると考えられます。

この手法の意義は、生体内におけるタンパク質折りたたみプロセスの理解へと広がります。このプロセスは、主にリボソームでの翻訳中に共翻訳的に起こると考えられていますが、本研究では市販の細胞抽出液を用いたγ-クリスタリンの無細胞翻訳を用いています。また、この手法は、あらゆる細胞源から調製した翻訳能を有する抽出液を用いることで、潜在的にあらゆるタンパク質の翻訳後分解（IDE）を特定することにも応用可能です。一般的に、この方法に不慣れな方は、プロトコルの2つの重要なステップで苦労することが予想されます。

1つ目は、翻訳反応に要する全体の時間を決定することであり、これにより、新生ポリペプチドの大部分がリボソームに結合した状態に留まることを確実にします。2つ目は、新生ポリペプチドの大部分を分離するための適切な調整システムを見つけることであり、調整システムの選択は研究対象となるタンパク質のサイズによって決まります。私たちは、80年代半ばに、グロビンの共翻訳フォールディングの提案モデルに関連して、グロビン分子の翻訳速度論を検討しようと決めた際に、初めてこの手法を考案しました。

グロビンの翻訳の不均一性は、1974年にPROとMauriceがグロビンNAS鎖のサイズ排除CLOクロマトグラフィーを用いた際に初めて注目されました。しかし、彼らの分析では十分な精度が得られず、Proとmoreはグロビンの翻訳中に4つの主要な翻訳パワーサイトを観察しました。その後、我々の分析により、さらに約10個のパワーサイトが明らかになり、グロビンの翻訳フォールディングの詳細なモデルが構築されました。本手法ではポリソームの単離とTris-SDS-PAGEゲルを用いた新生ポリペプチドの分析を行うため、視覚的な実演が極めて重要です。

これらのステップはどちらも、高品質で再現性のある結果を得るために不可欠です。実演を行うのは、Myelo研究室の大学院生Sujataです。メッセンジャーRNAのin vitro転写について説明します。まず、適切な制限酵素を用いてT7および/またはSP6プロモーターの下流にクローニングされた目的遺伝子を用意し、ストップコドンおよび/またはmRNA 3'末端の下流でDNAテンプレートを線状化します。

制限酵素消化後のサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけ、DNAが完全に直線化していることを確認します。最適なDNAテンプレート濃度を決定した後、製造元の指示に従って転写キットを用い、メッセンジャーRNAをin vitro転写します。次に、塩化リチウム沈殿を用いてmRNAを精製します。

次に、アクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動を用いて、その純度を確認します。ヌクレアーゼフリー水を用い、1 mMのアミノ酸混合物（メチオニンを除く）、10 unitsのRNAインヒビター、20 µCiの放射性$^{35}\text{S}$メチオニン、およびウサギ網状赤血球ライセートを添加して、100 µLのin vitro翻訳反応液を調製します。続いて、反応液を30 °Cで5分間インキュベートし、予熱します。

次に、2 µgのmRNAを加え、30 °Cで5分間インキュベートして反応を停止させ、氷上に置いてリボソームに結合した新生ポリペプチドを単離します。翻訳反応液を、塩化カリウムと塩化マグネシウムを含む30% glycerol Tris-HCl（pH 7.6）4.5 mLの上に層状に重ね、TLA 110ローターを備えた遠心機を用いて、4 °Cで100,000 ×gにて1時間遠心分離します。次に、上清を慎重に取り除き、新生ポリペプチドを含むポリソームペレットを、0.5 mg/mLのリボヌクレアーゼAを含む1 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.6）の少量で再懸濁し、37 °Cで30分間インキュベートします。

ペプチドのtRNAエステル結合の加水分解を促進するため、最終濃度10 millimolarの水酸化ナトリウムを反応液に加え、さらに30分間インキュベートします。新生ポリペプチドをTris-Tricine SDS-PAGEで分離し、その後、ゲルの固定と乾燥を行います。ゲルをオートラジオグラフィーに供し、続いてホスホイメージングを用いて新生ポリペプチドを検出します。

tRNAプールの変化によって誘発されるリボソーム移動の変動は、翻訳中に蓄積する新生ポリペプチドのサイズ分布の変化、およびそこでの休止時間を反映する相対的な強度の変化をもたらすはずです。γ-クリスタリンBタンパク質の新生ポリペプチドを単離し、Tristine SDS-PAGEを用いて分離しました。RRL（ウサギ網状リボソーム）系と大腸菌（e coli）系におけるポリペプチドの長さと強度が一致しないことは、これら2つの系におけるmRNAに沿ったリボソームの移動が、異なる翻訳キネティクスに従っていることを示しています。

例えば、ウサギ網状赤血球ライセート系には見られない、E. coliライセートにおける顕著な17.7 kilodaltonのバンドに注目してください。Gamma B crystallineは、哺乳類系では頻繁に現れますが、E. coliでは極めて稀であり、翻訳速度が遅いことが知られているタンデムアルギニンコドンを有しています。このことは、ここで示されているように、これらのタンデム希少コドンにおけるリボソームの停止が、このバンドの原因であることを示唆しています。

mRNAが存在しない場合にはバンドは観察されず、ピューロマイシン処理によってポリソームから新生鎖の大部分が除去されます。さらに、ピューロマイシンによる長時間の処理ですべての新生鎖が除去されることから、観察されたポリペプチド産物は、ポリソームと共沈するMRPではなく、リボソーム結合新生鎖であることが確認されます。この手法に習熟すれば、1〜2日で完了させることができます。手順に要する時間は、主に遠心分離ステップと新生ペプチドのゲル電気泳動ステップの時間に依存します。

この手順を行う際は、インキュベーション後すぐに翻訳反応を停止させることが重要です。新生ポリペプチドがリボソームから解離するのを防ぐため、あらゆるステップにおいてRNAの混入を避けることが極めて重要です。RNAが混入すると、抽出液の翻訳効率に影響を及ぼし、本手順に従った後のリボソームからの新生ポリペプチドの解離につながる可能性があります。

例えば、特定のメッセンジャー上のリボソーム移動効率に対するmRNA結合タンパク質の影響など、他の目的についても、本手法の開発後に検証することが可能です。この手法は、タンパク質折り畳みの分野の研究者が、翻訳における希少コドンの存在に起因する翻訳停止（ポージング）の役割を探索する道を切り拓きました。また、本手法は、あるメッセンジャー上のリボソーム移動および翻訳後タンパク質折り畳みにおけるコドン置換の役割を検証するためにも、以前に活用されています。

このビデオを視聴することで、リボソームに結合した新生ポリペプチドを単離することにより、提示されたmRNAの翻訳活性部位を特定する方法について十分に理解できるはずです。放射性同位体や、例えば ³⁵S-メチオニンのような標識アミノ酸を取り扱う際は、特別な予防措置が必要であり、この手順を実行する際は常にそれを考慮することを忘れないでください。