マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目的は、表現型および機能的特性を解析するために、マウスの腸管樹状細胞（dc）およびマクロファージを迅速に単離することです。まず腸管組織を採取し、次に腸管上皮を固有層から分離させることでこれを達成します。

次に、手順の最終段階として腸管固有層を消化します。固有層細胞を蛍光標識抗体で染色し、特定の細胞集団をゲーティングします。最終的に、腸管DCおよびマクロファージ集団をより正確に特性評価し、サイトカイン産生、抗原提示、および免疫細胞の調節を評価するための機能研究に向けて精製することが可能になります。

本手法の既存手法に対する主な利点は、組織消化が迅速であるため、細胞表面抗原の発現、細胞生存率、または細胞状態を最適に維持できることです。マウスを安楽死させ、足指つまみ反射で死亡を確認した後、動物の腹部と胸部に70% ethanolをスプレーしてください。次に、鋏を用いて腹部中央に小さな水平切開を加え、皮膚を剥いで腹膜を露出させます。

幽門括約筋で切断して胃と上部小腸を分離し、ピンセットで腸間膜を剥離した後、ハサミで腹膜を開きます。次に、回盲弁で再び切断し、小腸全体を大腸から切り離します。引き続き大腸から腸間膜を剥離し、肛門縁で切断します。

ハサミを用いて結腸を縦方向に切り開き、室温のC-M-F-P-B-Sを使用して腸管腔内の糞便内容物と粘液を洗浄します。次に、ハサミとピンセットを用いて、小腸の腸間膜反対側に沿ってパイエル板を肉眼的に切り出し、小腸を縦方向に切り開きます。

次に、室温のC-M-F-P-B-Sを用いて、小腸管腔内の糞便および粘液を洗浄します。別途、小腸と大腸を約1.5 cmの断片に切り分け、FBSと2 mM EDTAを含む、あらかじめ加温したC-M-F-H-B-S-S 30 mLが入った個別の50 mLコニカルチューブに入れます。各50 mLコニカルチューブをオービタルシェーカーに水平に設置し、37 °Cで250 RPMにて20分間振盪します。

次に、廃棄用バケツの上にメッシュワイヤーストレーナーを1つ置きます。各50 milliliterコニカルチューブの内容物をメッシュに通して腸管片を回収し、2 millimolar EDTAを含むFBS添加Prewarm C-M-F-H-B-S-S 30 millilitersを入れた新しい個別の50 milliliterコニカルチューブに移します。最後に、チューブをオービタルシェーカーに戻し、さらに20分間振とうします。

2回目の振盪後、各チューブの内容物をストレーナーに通して注ぎます。再びペーパータオルで余分な培地を吸い取り、その後、腸管片を小型のプラスチック製ウェーボートに移します。この手法で最も困難な点は組織の消化であり、成功させるためには、消化時間の設定、コラゲナーゼの特性、組織の完全性、および消化させる組織のサイズといったあらゆるパラメータを考慮し、ハサミを用いて迅速に操作する必要があります。

腸管片を細切し、その刻んだ腸管を20 mLのコラゲナーゼ溶液を含む50 mmコニカルチューブに加えます。コニカルチューブをオービタルシェーカーに水平に設置し、37 °Cで200 RPMにて10〜20分間、腸管片を消化させます。次に、チューブを短時間ボルテックスして、残った腸管組織を完全に解離させ、その後、細胞スラリーを100 µmのセルストレーナーでろ過し、50 mLコニカルチューブに直接回収します。

最後に、コニカルチューブの残りの容量をFBS添加C-M-F-H-B-S-Sで満たし、細胞懸濁液を4°C、425 ×gで5分間、2回遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷したFBS添加C-M-F-H-B-S-Sで再懸濁し、サンプルを氷上に置きます。その後、目的の細胞表面タンパク質で細胞を染色します。

まず、ここで示すように、死細胞染色陽性の細胞を除外するドットプロットを作成します。次に、ここでおよびここで示すように、ダブレットイベントを除外します。続いて、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）チャネルを用いて、デブリを除外しながら目的の細胞をゲートします。

次に、CD 45陽性およびIAB陽性の抗原提示細胞をゲートして別のドットプロットを作成します。個別のドットプロットで、特定のDCおよびマクロファージサブセットを区別するための領域を設定します。ここで示されているR1領域は、CD 11 C陽性かつCD 11 B dull negativeの細胞を抽出したものです。

R2領域は、R1領域の細胞と同様のレベルでCD11Cを表面発現しているが、同時にCD11Bも発現している細胞を定義します。R3領域は、CD11B陽性かつCD11C dull negativeである細胞を示します。これら3つの領域をさらにF4/80およびCD103の発現について解析することで、それぞれマクロファージ集団とDC集団を区別することができます。このドットプロットに見られるように、R1領域のCD11C陽性CD11B dull negative細胞は、高レベルのαE CD103と低レベルのF4/80を発現します。

このドットプロットは、R2領域のCD 11 B陽性CD 11 C陽性細胞が、CD 1 0 3およびF four 80の二分的な発現に基づき、DCとマクロファージの両方で構成されることを示しています。最終的に、F four 80陽性かつCD 1 0 3陰性の表現型プロファイルR3に基づき、ゲートされたCD 11 B陽性CD 11 C陰性細胞はマクロファージで構成されます。組織消化時間と全細胞回収数、およびCD 11 BとCD 11 Cの発現との関係を、以下の6つの図に示します。3分間消化した腸組織では全細胞数が少なくなり、その結果、特性解析に利用可能なDCおよびマクロファージが少なくなります。11分間の組織消化では、生存細胞が高い回収率で得られ、CD 11 BおよびCD 11 Cを高レベルで発現し、表現型として明確に区別されるDCおよびマクロファージの集団が得られます。

対照的に、50分間の消化では、最適化した消化と同程度の細胞回収率が得られます。しかし、CD 11 BおよびCD 11 Cを用いた異なる細胞集団の区別はより困難になります。これは、CD 11 Cの発現が減少し、死細胞数が増加するためです。

このように、腸管組織の消化パラメータを最適化することで、効率的に十分な細胞回収量を得ることができます。その結果、マウス腸管のdcsおよびマクロファージを迅速に単離することは、表面抗原が保持された免疫細胞の機能的特性を評価する上で有用です。