肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

この手順の全体的な目標は、肝臓などの食事誘発性炎症の影響を一般的に受ける組織からマクロファージを効果的に分離し、特徴付けることです。この方法は、組織に常在するマクロファージ表現型が慢性炎症性疾患の進行をどのように決定するかについて、免疫学および炎症学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これの主な利点は、この手順により、肥満媒介性の低悪性度慢性炎症の影響を受けた組織に由来する単一細胞懸濁液を得るために必要な単離ステップが最適化

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるジョセリン・アレンです。肝臓を単離するには、まずエタノールに浸したマウスを発泡スチロール解剖板上の仰臥位に置き、前足と後足を固定します。次に、中先端の鉗子を使用して尿道開口部近くの腹部の皮膚をつかみ、鋭い解剖ハサミを使用して隆起した皮膚に小さな切開を作成します。

ハサミの下刃を皮膚と腹膜の間の切開部に挿入し、鼠径部から顎にかけて横方向に切開します。皮膚をそっと引き戻して、無傷の腹腔と胸壁を露出させ、腹膜を通して横方向に切開します。胸骨を持ち上げ、ダイヤフラムを慎重に切開します。

次に、胃腸器官を横に移動し、肝下下大静脈またはIVCを見つけます。止血鉗子を使用して、肝上IVCをクランプして局所的な灌流を維持し、事前に温めた灌流バッファーで満たされたシリンジを23ゲージの採血および輸液セットに取り付けます。チューブと針が灌流バッファーで満たされるまでプランジャーを静かに押し下げ、針を肝下IVCと平行に挿入します。

IVCの適切なカニューレ挿入により、解離バッファーが肝臓と末梢組織全体に局所的に分布し、組織の消化が最適化されます。4センチメートルの止血クランプを使用して針を所定の位置に固定し、プランジャーを静かに押し下げて灌流を開始します。針が適切に配置されている場合、色は肝臓から急速に洗い流され、葉は拡大します。

灌流バッファーが肝臓を自由に流れるように門脈を迅速に切断し、時々親指と人差し指の間の葉を優しくマッサージして、血液の除去を促進します。灌流バッファーが5ミリリットルしか残っていない場合は、灌流バッファーシリンジを予め温めた解離バッファーで満たされたシリンジと交換し、葉を優しくマッサージし続け、肝臓が完全に消化されるまで灌流します。一対の鉗子の鈍い端を左側葉にそっと押し込むことにより、消化が成功したことを確認します。

鉗子が取り除かれるとゆっくりと充填される表面にくぼみが現れるはずです。次に、針を取り外し、解剖はさみから短いまっすぐな刃を使用して、接続靭帯を慎重に切断し、肝臓全体と胆嚢を切除します。肝臓を10ミリリットルの氷冷DMEMが入った10センチメートルの皿に移し、歯付き鉗子を使用して切断された肝上IVCをつかみます。

中点鉗子を使用して、各ローブに急速なストローク動作を適用して、グリッソン嚢から細胞を解放し、飽和DMEMを氷上の50ミリリットルの円錐管内の70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。生存細胞の高収率は、グリッソン嚢から肝細胞を適切に解離することによってのみ達成できます。すべての細胞を採取したら、チューブを反転させて細胞懸濁液を穏やかに混合し、遠心分離により細胞をペレット

上清を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、さらに3回の低スピン遠心分離を行います。最後の遠心分離後、上清を新しい50ミリリットルのチューブに移し、細胞を高速でもう一度遠心分離します。次に、非実質細胞ペレットを計数用のFACS緩衝液に再懸濁し、標識された5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブで肝細胞を下流の用途に応じて適切な濃度に希釈します。

高脂肪食または高脂肪高コレステロール食を与えられたマウスは、大動脈などの罹患組織における古典的に活性化されたM1マクロファージの浸潤の増加を示します。抗炎症表現型を示す大動脈CD45陽性F4/80陽性マクロファージを発現するRON受容体は、高脂肪、高コレステロール食を与えられたマウスで減少しますが、炎症誘発性CD45陽性F4/80陽性CD11c陽性マクロファージは、これらの動物から分離された大動脈で増加した数で見られます。さらに、消化された大動脈に由来するマクロファージを発現する選別されたRON受容体は、確立されたM2マクロファージマーカーであるアルギナーゼ1遺伝子の発現の増加を示します。

実際、肝臓に常在するマクロファージの特性評価は、CD11c陽性の炎症誘発性マクロファージ集団を持つRON受容体発現亜集団の一般的な表現型を明らかにし、抗炎症性M2表現型に強く関連する遺伝子の発現が減少することを示しています。同様の傾向は、消化された白色脂肪組織から単離されたマクロファージ集団でも観察され、炎症誘発性表現型マクロファージ集団はRON受容体の表面発現の減少を示します。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、動物ごとに20〜30分で完了することができます。

この手順に続いて、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞ソーティング、および/または定量的PCRなどの他の方法を実施して、単離された肝臓由来組織常在マクロファージの表現型をさらに特徴付けることができます。このビデオを見れば、病気の肝臓から組織に常在するマクロファージを適切に分離する方法を十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。