ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

このビデオでは、HEK 293T細胞を用いた分泌タンパク質の発現における、時間とコストを効率化した手順について説明します。まず、6ウェルプレートで40%コンフルエントのHEK 293T細胞培養液を準備します。次に、無血清培地でGeneJuiceとテスト用プラスミドを希釈し、トランスフェクション混合液を作成します。

トランスフェクション混合物を細胞に添加し、37 °Cでインキュベートしてタンパク質を発現させます。上清中のタンパク質の検出は、ウェスタンブロッティングにより行うことができます。適切なコンストラクトが特定されたら、10層セルファクトリーを用いて手順をスケールアップすることが可能です。

PEIをトランスフェクション試薬として用いて細胞にトランスフェクションを行います。タンパク質は、タンジェンシャルフローろ過に続きアフィニティークロマトグラフィーを行うことで、培養上清から回収できます。最終的に、このプラットフォームにより、広範囲のマクロ分子をミリグラム量で発現させることが可能になります。

バクロウイルスを用いた昆虫細胞発現などの既存手法に対する本手法の主な利点は、多数のコンストラクトをスクリーニングし、発現に向けてスケールアップさせることができ、わずか3週間で結果が得られる点にあります。この手順の実演は、私の研究室の大学院生3名であるHello Aiden、Shada Zini、Jonathan Cookが行います。まず、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの容量で250,000個のHEK 293T細胞を播種します。次に、10% FBSとペプチドを添加したDMEMを各ウェルに1 mLずつ加え、プレートを揺らして細胞を均一に分散させます。

その後、細胞を37 °Cの5%二酸化炭素加湿インキュベーターで一晩培養します。細胞のコンフルエンシーが約40%に達したら、SUP natumを2 mLの新鮮な培地に交換し、トランスフェクション混合液を調製します。まず、エンドルフチューブに90 µLの無血清DMEMを分注します。

次に、3 µLのトランスフェクション試薬であるgene juiceを加え、チューブの内容物を穏やかに混ぜて、室温で5分間インキュベートします。続いて、トランスフェクションに用いる、100 ng/µLストックのmini-prep精製プラスミドDNAを10 µL加えます。

チューブの内容物を混ぜ合わせ、室温で15分間静置します。トランスフェクションを行うため、混合液をHEC 2 9 3 T細胞に滴下します。プレートをゆっくりと揺らしながら1滴ずつ滴下し、トランスフェクション混合液を均一に分散させてください。

その後、細胞を37°Cでインキュベートします。24時間後、各ウェルに1 mLの新鮮な培地を加え、さらに48時間インキュベートします。トランスフェクションの3日後に上清を回収し、ウェスタンブロッティングにより目的タンパク質の発現レベルを検出します。

適切なコンストラクトが特定されたら、トランスフェクションの手順をスケールアップできます。10層のセルファクトリーを使用し、5% FBSを添加したDMEM 1.2リットルをセルファクトリーに満たします。次に、2億個のHEK 293T細胞を、すべての層に均等に分散させて加えます。

100%コンフルエントまで増殖させた225 cm²のTフラスコ4本には、約2億個の細胞が含まれています。細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。840 µgのDNAを84 mLの滅菌1×PBSで希釈し、T 75フラスコ内でトランスフェクション混合液を調製します。

1 mg/mLのポリエチレンイミン（PEI）溶液を2.5 milliliters加え、混合液を室温で15分間インキュベートします。溶液は濁った状態になります。次に、トランスフェクション混合液をセルファクトリーにゆっくりと注ぎ、全体に均一に分散させます。

全体の層。最終濃度が 4 mM になるようにバルプロ酸を添加します。これにより、トランスフェクション混合物の添加後、発現量が向上します。

タンパク質を発現させるため、培養物を37°Cで4日間インキュベートします。トランスフェクションの4日後に培地を回収し、すぐにセルファクトリーを洗浄して再利用できるようにします。回収した培地を4°Cで6,000 G、30分間遠心分離し、0.22 µmのステリックカップ真空ろ過装置でろ過して粒子状物質を除去します。次に、CentraMateタンジェンシャルフローろ過システムを使用して、上清を75 mLまで濃縮します。

上清を濃縮した後、アフィニティークロマトグラフィーによって目的タンパク質を精製できます。本実験では、ここに記載する大規模システムを用いて、ヒトAAL two受容体細胞外ドメインのHAタグ付きサブユニットを精製し、続いて高親和性抗HAクロマートグラフィーを行いました。これは、このクマシー染色SDS-PAGE解析に示されています。

インターロイキン2受容体αおよびγサブユニットの細胞外ドメインは、40 kilodaltonsおよび46 kilodaltonsの分子量で移動します。IL2 RαおよびIL2 Rγに存在するEnLink糖鎖の不均一性により、SDS-PAGEゲル上でバンドの広がりが生じました。より高分子量のバンドは、混入したBSAを示しています。

このビデオを視聴することで、10層セルファクトリーを用いてヒト細胞培養からタンパク質を発現させる方法について十分に理解できるはずです。HEK 293T細胞はバイオハザード物質とみなされ、バイオセーフティーレベル2で取り扱う必要があることに留意してください。常に適切な個人用保護具を着用し、表面の消毒は機関および政府のガイドラインに従って行ってください。