単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

本手順の全体的な目的は、単一の卵母細胞におけるDNAメチル化を解析することです。まず、採取した卵母細胞からキュムルス細胞およびソープパリタを除去します。次に、微量のDNAが消失または分解されるのを防ぐため、卵母細胞を2:1のaros溶解液に封入します。

次に重亜硫酸塩変異導入を行い、続いてネスティングPCRによる増幅を行います。最終ステップとして、PCR産物のライゲーションとクローニングを行います。その後、クローンを選別してPCR増幅し、シーケンシングに供します。

最終的に、重亜硫酸塩変異導入およびシーケンシングを用いて、単一の卵母細胞における標的領域のシトシン-ホスホグアニジン、すなわちCpGジヌクレオチドのDNAメチル化を明らかにします。大量の細胞を用いた重亜硫酸塩変異導入などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞をプールすることなく単一の卵母細胞からデータを取得できるため、PCRバイアスや化学細胞の混入を避けられる点にあります。卵母細胞の回収日には、書面によるプロトコルに記載されている溶液を新たに調製してください。溶液を調製する際は、頻繁に手袋を交換し、フィルターチップを使用することで、DNA汚染の可能性を低減してください。また、チューブを開けているときは傾けて保持し、使用していないときはすべてのチューブに蓋をしてください。

解剖したマウスの輸卵管をM2培地に置き、Mピレットで吸い上げて卵丘細胞複合体を抽出することで、OSI回収を開始します。次に、30 µLのM2培地滴中の0.3 mg/mLヒアルロニダーゼ溶液を用いて、卵丘細胞複合体から卵子を分離します。長時間にわたる曝露は卵子に損傷を与える可能性があるため、卵丘細胞を除去するのに必要な最小限の時間のみ、卵子を溶液中に保持してください。

卵母細胞を30 µLのM2培地の液滴に順次移し、洗浄します。クムルス細胞を定期的に除去しながら、計3回の洗浄を行います。酸性タイロ溶液を用いてLUCITAのZを除去します。

まず、卵母細胞を30 µLの溶液ドロップ1滴に移し、次に別の30 µLのドロップへと移します。これは、一緒に持ち越された培地が酸を希釈し、その効率を低下させるためです。長時間にわたる曝露は細胞にダメージを与える可能性があるため、透明帯を除去するのに必要な時間だけ、細胞を溶液中に保持してください。

透明帯を除去した後、細胞を30 µLのM2培地の滴で再度洗浄します。Agaroseへの包埋を行うため、まず溶解液を70 °Cのヒートブロックに置きます。あらかじめ加熱した低融点（LMP）Agaroseを溶解液に加え、Agaroseと溶解液の比率を2:1にします。次に、少量のM2培地を用いて、単一の卵母細胞を清潔なガラススライド上に配置します。

次のステップは、単一細胞をAgrosおよび溶解溶液に埋め込むことです。Agrosは65°Cを下回る温度で凝固するため、この操作は迅速に行う必要があります。顕微鏡下で、ピペットチップを用いてAgros溶解溶液を10 µL分採取します。

約1 µL以下のagros溶解液をスライドガラス上に静かに滴下し、最小培地と混合させます。ピペットチップで卵母細胞をそっと吸い上げます。その後、300 µLのミネラルオイルが入ったエッペンドルフチューブに計10 µL分を移し、得られたビーズが球形になるようにします。

溶解を行うため、チューブを氷上で10分間インキュベートします。300 µLのミネラルオイルを除去し、500 µLのSDS溶解バッファーを加えます。2日目に、50 °Cに設定したウォーターバスでサンプルを一晩インキュベートします。

記載されているプロトコルに従い、二硫化ムタゲネシス溶液を調製して直ちに使用してください。SDS溶解バッファー 500 µL を完全に除去して、ムタゲネシスを開始します。溶解バッファーが残っていると、加熱時にアグロスが希釈され、その後の工程でビーズが溶解しやすくなることに注意してください。

溶解バッファーを完全に除去した後、ミネラルオイルを300 µL加えます。サンプルを90 °Cのヒートブロックで2分30秒間インキュベートします。この際、混合や攪拌、または温度を変動させないよう注意してください。

2分30秒後、サンプルを氷上で10分間インキュベートします。変性を行うには、ミネラルオイルを除去し、0.1 M 水酸化ナトリウムを1 mLチューブに加え、チューブを軽く弾いてから5〜6回反転混和します。

サンプルを15分間インキュベートします。37 °Cに設定したウォーターバス中で3〜4分ごとに反転させます。ビーズが水酸化ナトリウム中で浮上していることを確認してください。ビーズがチューブの底になくなってください。

亜硫酸塩処理を行うには、まず水酸化ナトリウムを除去した後、チューブを軽く遠心分離します。300 µLのミネラルオイルと500 µLのBIS亜硫酸塩溶液を加えます。光にさらされないように注意し、50 °Cの水槽で3時間30分間インキュベートします。

次に脱塩を行います。まず、サンプルを氷上で3分間インキュベートした後、ミネラルオイルとBIS亜硫酸塩溶液を除去します。軽く遠心分離した後、0.3 Mの水酸化ナトリウムを1 mL加え、チューブを5〜6回弾くようにして転倒混和します。

サンプルを15分間インキュベートします。37 °Cのウォーターバスを用い、3〜4分ごとに転倒混和させてください。ここでも、PCRを開始する前にビーズが水酸化ナトリウム中で浮遊していることを確認してください。まず緩やかに遠心分離を行い、サンプルを洗浄します。

次に、水酸化ナトリウムを除去し、1 XTE (pH 7.5) を 1 mL 加えます。室温で5〜10分間振盪します。再度緩やかに遠心分離した後、1 XTE を除去します。

この洗浄工程を2回繰り返します。次に、1 mLのオートクレーブ済み二回蒸留水を加えます。室温で5〜10分間振盪し、3回目を緩やかに遠心分離して水を除去します。

2回蒸留水による洗浄を2回繰り返します。最後に、上清をすべて取り除き、arosビーズのみを残します。上清のpHが5.0であることを確認してください。

上清が依然として塩基性が強すぎる場合は、二回蒸留水でビーズを再度洗浄してください。その間に、書面の手順に従って第1ラウンドのPCRミックスをPCRチューブに加えます。固相アグロ速度をエキノールチューブの縁までスライドさせます。

次に、agro speedを慎重にPCRチューブに移し、70 °Cで1分間加熱して混合します。その後、記載のプロトコルに従って増幅を行います。第1ラウンドの増幅後、第1ラウンドの産物を鋳型として5 µL用い、第2ラウンドのPCR反応液を調製します。必ずミネラルオイル層の下にピペッティングしてください。

診断テストとして、本文の指示に従い2回目の増幅を行います。2回目のサンプルを、メチル化特異的または株特異的な制限酵素で切断し、消化産物を8%アクリルアミドゲルで電気泳動します。不均一なバンドが現れた場合は、複数の配列が存在することを示しています。2回目の産物をクローニングするには、ベクトルにライゲーションし、このビデオに付随する原稿に記載されているTAクローニングを行います。TAクローニング後、反応液すべてをアンピシリン、X-gal、およびIPTGを添加したLB寒天培地に播種し、37 °Cで一晩インキュベートします。

次に、書面の手順に従ってコロニーPCRマスターミックスをPCRチューブに加えます。ピペットチップでプレートから白い細菌コロニーを回収し、PCRチューブ内の35 µLのコロニーPCRマスターミックスの中で撹拌します。記述に従って懸濁液を増幅させ、PCR増幅後、PCR産物4 µLを1.5% AGROSゲルで電気泳動します。

最後に、1サイトあたり5つのコロニーPCRから、シーケンシング用にPCR産物を約30 µLずつ送ります。シーケンシング結果が得られたら、メチル化パターンを読み取ることができます。元のシトシン・グアニンがそのまま残っていれば、そこはメチル化されていました。逆に、ビスルフィット変換プライマーを用いたネステッドPCR増幅後に元のシトシン・グアニンがチミン・グアニンに変わっていれば、そこは未メチル化であったことになります。

アガロースゲルで正しい断片サイズを確認することで、変換が成功したかを確認することが可能です。2つの卵細胞はそれぞれ1つの親アレルを表しており、理論的にはそれぞれが1つの刷り込みメチル化パターンを有しています。そのため、2回目のPCR産物を用いて、意図しないコンタミネーションがないかを確認することができます。

DNAメチル化に感受性を持つ制限酵素を用いて第2ラウンドのPCR産物を消化し、メチル化アレルまたは非メチル化アレルが含まれているかを確認できます。ここでは、酵素認識配列内のメチル化シトシンが切断されます。一方、チミンに変換された非メチル化シトシンは、もはや酵素に認識されず切断されません。リゲーションおよび形質転換後、メチル化アレルと非メチル化アレルの両方が含まれるメタフェーズII卵子サンプルは、卵丘細胞の混入または極体の混入を示しているため、廃棄する必要があります。

コロニーPCR増幅の成功は、AROSゲルで可視化することで、正しい産物サイズのサンプルをシーケンシングに送ることが可能です。この例では、ライゲーション後の期待されるアンプリコンサイズは56 bpです。ここでは、クローン5はアンプリコンサイズが不適切であるため、シーケンシングに送るべきではありません。

中期2期卵母細胞から得られた5つの個別のクローンの配列は、5つすべてで同一のメチル化パターンおよび同一の非CPG変換率を示すはずです。2種類以上のパターンが含まれるサンプルはすべて破棄してください。排卵された中期2期卵母細胞は2つの染色体コピーを持つか、あるいは極体が付着しているため、2つの類似した配列パターンが得られる可能性があります。

メチル化パターンが著しく異なる細胞からのデータは破棄してください。この操作を行う際、卵丘細胞の混入を完全に排除することはできないため、まずHI IDE処理後に新鮮な培地で卵細胞を数回洗浄し、可能な限り多くの卵丘細胞を除去することが重要です。次に、低融点アガロースは65 °C以下の温度で凝固するため、慎重かつ迅速に作業してください。

最後に、硫酸水素ナトリウムとヒドロキノンは光に敏感であるため、反応チューブと溶液はアルミホイルで遮光してください。