単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

FollowMe実験の全体的な目的は、多数のニューロンから神経スパイク活動を記録することです。これは、まず蛍光顕微鏡を用いて、各活動電位に伴うニューロン細胞体内のカルシウム濃度の増加を観察することによって達成されます。2光子励起とランダムアクセススキャニング原理を用いることで、40個のニューロン細胞体から高空間・時間分解能でカルシウム蛍光信号を記録します。

第2ステップでは、デコンボリューションアルゴリズムを用いて、蛍光信号から正確なスパイクタイミングを抽出します。この手法を用いることで、数十個のニューロンからのスパイク活動を記録することが可能です。その後、得られたスパイクデータを用いて、相互情報量、ニューロン集団間の信号伝播、またはニューロン相関を測定することができます。

この手法の、マイクロ電極記録などの既存の手法に対する主な利点は、局所的な集団から多数のニューロンのスパイク活動を記録できることです。この方法は、情報の相関探索の重要性や、皮質可塑性に伴うネットワークダイナミクスの変化など、ニューロンの局所ネットワークレベルでの皮質機能に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。2光子励起には、フェムト秒パルスを持つ赤外線パルスレーザーシステムが使用されます。システムの光学部品によって導入される大きな損失を補うため、高いレーザー出力電力が求められます。

2つのプリズムで構成されるプリズマティック・ペアにより、カスタム光学デフレクターに到達する前にレーザーパルスに負の群速度分散を与え、AODによって導入される時間的分散を補正します。大口径の2つのAODが、レーザービームを2次元的に偏向させます。AODによって導入される空間的分散を補正するため、1mmあたり100本の溝を持つ反射型回折格子をAODの13cm後方に配置します。短パルスレーザーを使用する場合、レーザービームは2つのリレー望遠鏡を介して正立顕微鏡のカメラポートに導入されます。

光学部品を光軸合わせするため、一定の間隔でアイリス（絞り）を配置します。対物レンズ前方に配置されたダイクロイックビームスプリッターは、赤外励起光を試料に透過させ、試料からの蛍光を検出器に反射させます。エピ蛍光検出器および透過蛍光検出器で蛍光信号を収集し、励起光が検出器に到達するのを防ぐために、検出器の前方にコンデンサー用有色ガラスフィルターを配置します。

A ODの偏向角は、デジタル-アナログ変換ボードを搭載したコンピュータによって制御され、それがさらに電圧制御発振器を駆動します。光電子増倍管からの信号は、遮断周波数100 kilohertzの低域通過バターワースフィルタを介して伝達され、解析のためにコンピュータに保存される前に、156.25 kilohertzのクロックレートでアナログ-デジタル変換器によりデジタル化されます。アライメントおよび電気的ノイズの試験は、光電子増倍管の低ゲインおよび高ゲインにおいて、レーザー光の有無、および指示薬の有無による蛍光信号の分布を記録することで行われます。ジザリング・ランダムアクセス・スキャニングは、細胞内カルシウム濃度の増加の検出に依拠しています。プロトコルの最初のステップは、カルシウム指示薬のエステル型を大量のニューロンにバルカス注入して染色することです。

次に、各ニューロンの細胞体における活動を、4か所の部位でそれぞれ6.4 microseconds間記録します。対象となるニューロンを選択するために、256×256ピクセルで構成されるフルフレームを取得します。その後、この画像内で記録対象とするニューロンの中心を手動で選択します。

制御ソフトウェアにより、各サイクルで各中心の周囲2 µmの間隔に3つの点が自動的に追加されます。全40個のニューロンにおける4つの位置から蛍光信号が記録されます。1サイクルで全ニューロンから記録を行うのに要する時間は1.536ミリ秒です。

全40個のニューロンに対するこの連続記録を5秒間繰り返します。蛍光細胞体カルシウム信号からのスパイク検出は、高いSN比に依存します。励起強度を上げることで、高いSN比を達成できます。

しかしながら、光損傷が発生するため、励起強度は一定の限界までしか上げることができません。記録された信号が高感度なスパイク検出の範囲内にあることを保証するためには、光損傷が少なく、かつ単一スパイクを検出するのに十分なS/N比が得られる励起強度の範囲は非常に限定的です。実験中には、当研究室で開発した複数のオンライン解析ソフトウェアが使用されます。

次に、約100から200ミリ秒のベースラインノイズの短い時間窓から、ニューロンあたりの概算光子率を算出します。光子数および光子率は、相対的な蛍光変化の分布をこの方程式でフィッティングすることで蛍光値から算出します。その後、同じ時間窓からベースライン蛍光を算出し、それを時間または試行の関数としてプロットします。レーザー出力を調整し、ベースラインの平均減少率を1秒あたり0.0002以下に維持してください。

この制限を超えるとスパイク検出能が急速に低下するためです。その後は、フルフレーム画像を取得することで、10〜20分ごとにニューロン細胞体の位置を確認してください。必要に応じて記録位置を調整します。

神経活動に由来する蛍光信号は、カルシウム過渡現象の減衰が緩やかなため、時間的に遅延することがよくあります。本手順では、蛍光信号からスパイクおよびスパイクタイミングを抽出するために、デコンボリューション法を用います。ここでは、記録された蛍光信号に最も適合するスパイク列モデルを決定するために、遺伝的アルゴリズムを使用します。

アルゴリズムの反復ごとに、最大尤度は蛍光記録のノイズによって与えられる最大値に漸近的に近づきます。不均一なニューロン集団において、スパイク誘発カルシウム信号はニューロン間で異なる場合があります。大規模データセットの教師なし解析に向けて、我々は大量の偽陽性検出を避けるため、ニューロン間でのスパイク誘発カルシウム信号の変動を考慮したアルゴリズムを設計しました。

単一スパイク誘発カルシウムトランジェントの振幅と減衰時定数の共同分布は、同一条件下の同種のニューロンを用いて、別の実験セットで記録されます。緩やかなベースライン変動に対処し、デコンボリューションの計算コストを削減するため、長時間の記録は各記録の各ニューロンについて1〜5秒の短いトレースに分割されます。デコンボリューションアルゴリズムでは、最大100万個以上の膨大な数のモデルを検証する場合があり、処理速度を向上させるため、1つの実験を最大10台のコンピュータで並列にデコンボリューションします。

デコンボリューションの後、スパイクデータの解析と点検を行います。刺激周辺時間ヒストグラム（PSTH）のスパイク確率およびニューロンの発火率が自動的に算出されます。ここでは、検出ウィンドウ内において、非常に低い興奮率で記録された蛍光信号の例と、非常に高い興奮率で記録されたもう一方の例を示します。

各例は1回のスパイクに対する応答を示していることに注意してください。ここに示しているのは、急性脳切片と、同一の皮質カラムに配置された2本の刺激ピペットの顕微鏡写真です。第4層において、これらは反復刺激に対する神経応答を示しており、このグラフは記録されたニューロン集団によって伝達されるシャノンの相互情報量を示しています。

ここでは、異なる皮質ニューロン集団間における閾値超スパイク活動の伝播の測定を示します。これらは、視床皮質繊維への電気刺激に対する皮質ニューロンの検出されたスパイクです。ランダムアクセススキャンを用いてニューロン活動を記録する場合、検出ウィンドウ内で記録することが非常に重要です。

さもなければ、データセットが使い物にならなくなる可能性が非常に高くなります。光学的なスパイク検出はまだ初期段階にあり、改善の余地が多く残されています。

いくつかの改良を加えることで、さらに多くのニューロンから記録することが可能になります。また、別の改良により、覚醒状態で行動している動物においても記録できるようになります。