Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

本手順の目的は、機能的なβ細胞量の変化を調節するシグナル伝達経路を特定することである。これは、アデノウイルスベクターを用いて特定の遺伝子を過剰発現または抑制させることで、単離したラット膵島において達成される。この操作の後、インスリン分泌によるβ細胞機能の評価、およびトリチウム標識チミジンの取り込み量による膵島増殖の測定を行う。

最終的に、これらのアッセイにより、目的の遺伝子がin vitroでβ細胞の増殖および／または機能を調節しているかを確認できます。この手法は、シグナル伝達経路の特定の構成要素がβ細胞の増殖と機能に影響を与えるかなど、眼瞼生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。6ウェル非組織培養コーティングプレートを用意し、必要な数のウェルに2 mLの改変培地を添加します。

例えば、典型的な実験では、ウイルス陰性コントロール、ウイルスコントロール、および実験群のそれぞれに1ウェルずつ、計3ウェルが必要となります。プレートを組織培養インキュベーターに入れ、37 °Cで少なくとも30分間温めておきます。ラット眼球の分離直後、準備したプレートの各ウェルに1〜200個の眼球を配置します。60個の眼球は生化学的アッセイに使用し、残りの眼球は遺伝子発現解析または免疫ブロッティングに使用できます。プレートを静かに揺らし、眼球を各ウェルの中心に集めます。

その後、直ちにアデノウイルスをディッシュの中央にあるアイレットの上に直接ピペットで滴下します。目的タンパク質の過剰発現またはノックダウンにおけるアデノウイルスの有効性に応じて、感染多重度（MOI）を1〜500の範囲で使用してください。

アデノウイルスの眼瞼深部への効率的な浸透により、結果の再現性が向上します。眼瞼を分離させた直後に導入を行うことが不可欠です。

プレートを5分間静置した後、インキュベーターに移して24時間培養します。翌日、プレートをインキュベーターから取り出し、アイレットをウェルの中心まで緩やかに膨張させます。200 µL マイクロピペットを使用して、アイレットを新鮮な培地を含む新しいウェルに転送します。

アイレットがプレートに付着した場合は、ピペットチップでそっと剥がしてください。共焦点顕微鏡を用いてアデノウイルスがアイレットコア培養に浸透しているかを確認し、GFPを発現するコントロールウイルスを使用して、十分な導入効率が得られているか検証することが有用です。培地を毎日交換しながら、アイレットをさらに1〜3日間培養します。

培養時間はパイロットスタディによって最適化する必要があり、実験目的によって異なります。最後の24時間は、培地1 mLあたり1 µCiの濃度でトリチウム標識チミジンを培地に添加します。まず、50 mLコニカルチューブに50 mLのSABワーキングソリューションを調製し、37 °Cの恒温水槽で温めます。

15 mLコニカルチューブに10 mLのSABワーキングソリューションをピペットで分注し、2.5 M D-グルコースを66.8 µL加えます。高グルコースSABを調製するには、残りの40 mLのSABワーキングソリューションに2.5 M D-グルコースを44.8 µL加えます。次に、低グルコースSABを調製するため、1.7 mLマイクロ遠心チューブ3本にラベルを貼ります。

6ウェルプレートの各ウェルに対し、各チューブに1 mLのPBSを加えます。放射性標識された眼球の取り扱いおよび廃棄に関する施設内プロトコルに従うことを忘れないでください。実体顕微鏡または標準的な顕微鏡を用いて、大きさがほぼ同等の眼球を20個選択し、各マイクロ遠心チューブに転送します。

例えば、各チューブに小サイズ5個、中サイズ10個、大サイズ5個のアイルレットを含めることができます。実験の最後に全タンパク質含有量で結果を標準化しますが、群間でアイルレットのサイズを一致させることが極めて重要です。重力または遠心分離によってアイルレットをチューブの底に沈殿させた後、マイクロピペットでPBSを吸引して重量を測定し、その後、生化学的アッセイに向けてアイルレットの調製に進みます。

インスリン分泌アッセイに向けてアイレットを調製するため、まず低グルコースSABでプレインキュベートする必要があります。この操作を行うには、チューブに低グルコースSABを400 µL加え、キャップを閉めた状態で組織培養インキュベーターに入れます。60分後、プレインキュベーションに使用した低グルコースSABを吸引して除去します。基礎インスリン分泌量を測定する場合、このプレインキュベーションの手順を繰り返します。

ただし、刺激インスリン分泌量を測定する場合は、低グルコースSABの代わりに400 µLの高グルコースSABを使用します。前述と同様に、高グルコースまたは低グルコースSABでインキュベートした後、アイレットを60分間インキュベートし、インスリンラジオイムノアッセイ（製造元のプロトコルに従って実施）用のSABを吸引回収します。その後、同じアイレットを用いてチミジン取り込みアッセイに進みます。インスリン分泌アッセイに使用した直後のアイレットから開始してください。

PBSを1 mL加え、アイレットを重力で沈降させます。その後、マイクロピペットでPBSを吸引します。これを廃棄し、同様の操作をもう一度繰り返します。

次に、氷冷したトリクロロ酢酸を500 µL、アイレットに加えて、氷上で30分間インキュベートします。チューブを4 °Cで遠心分離します。その後、吸引してTCAを除去します。

次に、0.3 N 水酸化ナトリウムを 80 µL 添加し、アイレットを室温で 30 分間インキュベートします。このインキュベーションの間、10 分ごとに 5～10 秒間、サンプルを激しくボルテックスします。並行して、7 mL 液体シンチレーション計数管に Conno Safe カウンティングカクテルを 4 mL 添加します。

アイレットのインキュベーションが終了したら、アイレット 50 µLをシンチレーションチューブに加えます。キャップをしたチューブを軽く振り、液体シンチレーションカウンターでサンプルの放射能を測定します。また、タンパク質濃度を測定するために、10 µLのバイアルを市販のbionic acid assayに移し、製造元のプロトコルに従って操作してください。

後のデータ解析において、記載されたプロトコルに従い、結果をタンパク質濃度で標準化します。アイレットの複製とβ細胞機能について。ラットのアイレットにおいて評価したところ、仮想遺伝子6のアデノウイルスによる過剰発現は、β細胞機能を変化させることなく、アイレットの複製を強力に刺激しました。

遺伝子sixの発現が増加し、ラット膵島細胞の大部分がβ細胞であるため、チミジンの取り込み量で測定されるDNA合成が増加しました。さらなる実験により、このチミジン取り込みの増加がβ細胞の複製増加によるものであることを示す可能性があります。インスリン分泌アッセイにより、遺伝子sixの過剰発現は、低血糖および高血糖時におけるβ細胞の主要な機能の一つであるインスリン分泌を変化させないことが示されました。

低濃度および高濃度のグルコースにおけるインスリン分泌の増加は、アデノウイルス処理後の膵島の健全性を反映しています。もし遺伝子6の発現上昇がβ細胞機能を損なうのであれば、それは高濃度の刺激グルコースにおけるインスリン分泌の減少として現れると考えられます。このビデオを視聴することで、特定の遺伝子がβ細胞の増殖や機能に影響を与えるかどうかを判断するための、β細胞の複製およびインスリン分泌の測定方法について十分に理解できるはずです。