ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化

本唾液ペプチド研究では、ロリポップ型の超ろ過プローブを用い、次いでダイレクトnano LC LT Q質量分析による解析を行っています。まず、ポリエーテルスルホン膜とエチレンプロピレンチューブを使用してLLUFプローブを組み立てます。次に、ボランティアから唾液検体を採取し、LLUFプローブで処理して唾液をサンプリングします。

その後、直ちにnano L-C-L-T-Q質量分析に移行し、LLUFプローブ処理ありと処理なしの唾液サンプルのデータを分析します。最終的に、L-C-M-S-Sデータを分析し、2つのサンプル間で同定されたペプチドを比較することで、唾液ペプチドを得ることができます。ロリポップ状の超濾過プローブを直接的なnano lc LTQ質量分析に組み合わせるこのアプローチは、唾液タンパク質をペプチドに消化するなどの他の方法に比べて、主要な利点があります。

質量分析による解析に続き、LUF PROを用いて唾液の簡略化と精製を行い、臨床応用のための全唾液中のペプチドのMS検出能を向上させます。エポキシ接着剤を使用して、ポリエーテル細胞膜を三角形のポリプロピレンパドルの縁に封止します。その後、テフロン製フッ素化エチレンプロピレンチューブを三角形のシリンダー出口に取り付けます。

ポリプロピレン製パドルを用い、プローブを70%アルコールで一晩滅菌します。適切なシール性を評価するため、LLUFプローブを50 mg/mLのブルーデキストラン溶液に2時間浸漬します。回収したサンプル中にブルーデキストランが存在しないことを確認してください。

20歳から40歳の健康なボランティアを募集します。水で口をゆすいだ後、被験者に全唾液サンプルを氷冷した容器に吐き出させます。すべてのサンプルを合わせて、氷上で保存します。

採取後直ちに、LLUFプローブを用いたサンプリングのため、200 µLの唾液を持って4 °Cの室内に移動します。次に、培養皿に入れたヒト唾液中にポリエーテル細胞膜を浸します。シリンジで吸引して陰圧をかけ、唾液からのサンプリングのための限外ろ過プロセスを模倣します。

次に、タンパク質濃度を決定します。nano LC質量分析に用いるため、唾液タンパク質試料を1 µg/µLに調製します。試料分析には、Finnegan LTQ質量分析計にオンライン接続したExigent nano LCを使用します。まず、オートサンプラーを用いて、未消化の唾液試料5 µLをnano LCシステムのトラップカラムにロードします。

洗浄ステップの後、バルブを切り替え、バッファーBを0から50%の直線勾配でトラップおよびC 18分離カラムに供給します。Excaliburのデータ依存モードを使用し、強度が1×10⁴以上の上位4つのMSイオンのms/msスペクトルを収集します。各サンプルについて、3つの異なる独立した調製試料を用いて2回ずつ分析を行います。

次に、データファイルをSequest Sorcerer 2システムにインポートし、non enzyme specificityを用いて適切なヒトNCBIタンパク質データベースに対して検索を行います。Sequest検索後、結果は自動的にフィルタリングおよび検証され、Sequestの結果に基づいてペプチドプロファイルおよびタンパク質プロファイルに表示されます。ペプチドプロファイルでは、ペプチドの割り当てが正しいか誤っているかの包括的な確率であるPスコアを推定し、各ペプチド配列に関する追加情報も特定します。

Protein profitは、Ms.Msスペクトルに割り当てられたペプチドに基づき、各タンパク質に対して0から1までの確率スコアを算出します。本セクションでは、細菌検出培養において口腔細菌を除去するLLUFプローブの能力を判定します。好気性細菌の試験のため、LLUFプローブ採取前後の唾液サンプルをオーガプレートに播種します。37 °Cで1日間、抗生物質を含まないLBオーガプレートを使用し、嫌気性細菌についてはガスパックを用いて培養します。

サンプルをbruブロスおよびオーガープレートを用い、37°Cの嫌気条件下で1日間培養します。ロリポップ型の超濾過デバイスを作製することで、擬似的な口腔環境における唾液のサンプリングが容易になります。このシステムでは、分画分子量30 kilodaltonsの負電荷ポリエーテルスルホン膜をポリプロピレン製パドルに接着し、LLUFプローブの前方に配置することで、唾液中の大きなタンパク質を濾過します。

ヒトの口腔内環境を模倣するため、シリンジを用いてスポンジに唾液を浸透させます。唾液は接続されたチューブを介してろ過され、回収されます。LLUFサンプリング前後の唾液のLCクロマトグラムを比較し、nano L-C-L-T-Q質量分析法を用いて唾液固有のペプチドを同定しました。

これらの微分クロマトグラムは、化学的または酵素的な消化を経ずに得られるため、臨床目的の試料調製を簡略化できます。本試料において、LLUFによる異なるタンパク質組成の解明により、未消化の唾液中に131種類のペプチドが同定されました。

これらのペプチドは、さまざまなプロリンリッチタンパク質に由来する断片です。Actin、alpha amylase、alpha one globin、beta globin、his sustain one、keratin、one mucin、seven polymeric immunoglobin receptor、serin、および S 100 が含まれます。LLUFプローブでろ過した後に唾液中で同定された 26 個のユニークなペプチドは、主にさまざまなプロリンリッチタンパク質に由来する断片です。

α-アミラーゼ由来のこのペプチドは、LLUFプローブを用いずに採取した唾液サンプルのみで検出されており、大きなタンパク質を除去するLLUFプローブの能力が示されました。非常に興味深いことに、大きなタンパク質を除去した後、LLUFプローブで採取した唾液からいくつかの配列ペプチドが検出可能となり、特にプロリンに富むC末端を持つペプチドが、超ろ過LLUFプローブ後のサンプルで同定されました。これで、質量分析のために単純な唾液に対してA-L-L-L-L-U-F PROを使用する方法を十分に理解できたはずです。

一貫した条件下で唾液を簡便に採取し、より精度の高い分析を行うことは非常に重要です。この手法を習得すれば、3時間以内に適切に実施できると考えられます。ロリポップのような超ろ過プローブとダイレクトnano LC-LTQ-MSを用いたこのアプローチによるスペクトル連鎖分析は、ヒト疾患の診断におけるバイオマーカーの臨床応用に寄与します。