シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

この標準的な手法により、侵入ポディウム（invaded podia）によるマトリックス分解の定量アッセイに適した、蛍光標識ゼラチンでコーティングされたカバーガラスを作製します。蛍光標識ゼラチンでカバーガラスをコーティングした後、細胞を播種し、マトリックス分解のために培養します。次に、細胞を固定して侵入ポディウムのマーカータンパク質を蛍光染色し、画像を撮影してマトリックスの分解量を定量します。

典型的な結果により、特定の遺伝子の操作や薬理学的薬剤による処理を受けた細胞間における、inv podiaを介したマトリックス分解の差を定量化できます。蛍光ゼラチンのコーティングムラや、ゼラチンコーティングされたカバースリップの不適切な取り扱いにより、均一な蛍光を持つゼラチンコーティングカバースリップの調製は困難であるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。手順の実演は、リサーチ・アシスタント・プロフェッサーのKaren Martin、ポストドクターのMandy Ammer、および大学院生のElise Walk、Karen Hayes、Steve Markwellが行います。

ラベルなしの5%ゼラチンショ糖ストック溶液を調製するには、PBS中でゼラチンとショ糖を混合し、37 °Cで完全に溶解させます。その後、4 °Cで保存してください。続いて、ガラスカバースリップの洗浄を行います。

24ウェルプラスチック組織培養プレートの各ウェルにカバーガラスを1枚ずつ配置し、20% 硝酸を500 µLずつ加えて30分間インキュベートします。硝酸溶液を除去した後、カバーガラスを脱イオン水で3回洗浄します。次に、コーティングを行います。

各カバーガラスに50 µg/mLのポリリジンを500 µL加え、室温で20分間インキュベートします。ポリリジン溶液を除去し、PBSで3回洗浄します。ポリLリジンコーティングにより、上層に塗布する標識ゼラチンの均一なコーティングと結合が促進されます。24ウェルプレートを氷上に置き、各ウェルに調製直後の0.5%グルタルアルデヒドを500 µL加えます。

プレートを氷上で15分間インキュベートします。冷PBSで3回洗浄し、ゼラチンコーティングの前にPBSを完全に吸引します。その間に、グルタルアルデヒドでのインキュベーション中にOregon Green 488結合ゼラチンを再構成します。

製造元のプロトコルに従い、標識ゼラチンと未標識の5%ゼラチン・スクロースストック溶液を37°Cに温めます。次に、標識ゼラチン500 µLを未標識ゼラチン4 mLで希釈します。希釈した4 88ゼラチン混合液を、カバーガラス1枚につき100 µLずつ分注します。

手動で広げることなく、カバーガラスをコーティングするのに十分な量のゼラチンを使用します。早すぎる凝固を防ぐため、コーティング手順の間、希釈した4 88ゼラチン混合物を37 degreesに維持することが重要です。また、このステップ以降は、光退色の可能性を避けるため、カバーガラスを可能な限り暗所に保管してください。

1枚のプレート内のすべてのカバーガラスへのコーティングが完了したら、プレートを傾け、各ウェルから過剰なゼラチンを真空吸引で除去します。次に、コーティングしたカバーガラスを室温、暗所で10分間インキュベートします。カバーガラスをPBSで3回洗浄した後、500 µLのホウ酸ナトリウム緩衝液を加えます。

水素化ホウ素ナトリウムは発泡するため、各カバーガラスの表面や周囲に小さな気泡が現れます。残存するグルタルアルデヒドを還元して不活性化させるため、室温で15分間インキュベートします。各ウェルの外側を素早く掃くように真空吸引し、水素化ホウ素ナトリウム溶液を除去します。この際、水素化ホウ素ナトリウム処理中に組織培養プレートの底から剥がれて浮遊しているカバーガラスを吸い込まないように注意してください。PBSで3回洗浄した後、カバーガラスを70% ethanolで室温にて30分間インキュベートします。

無菌操作を用いて、プレートが入ったカバースリップをB細胞培養用のタイプ2層流クリーンベンチに移し、滅菌済み針とピンセットを使用してカバースリップを滅菌PBSで3回洗浄します。カバースリップを新しい24ウェルプレートの空のウェルに慎重に移動させ、使用する特定の細胞型の培養液でカバースリップを平衡化させます。

適切なインキュベーション時間の後、細胞をカバーガラス上に直接播種します。免疫蛍光イメージングのためにサンプルを処理し、封入を行います。顕微鏡スライドグラスの上にProlong Gold抗退色剤または同様の試薬を1滴滴下し、カバーガラスを慎重に倒置して配置して、解析用の画像を取得します。

この解析では、細胞の面積または細胞数に対するマトリックス分解の正規化面積を算出します。これは、irna増殖因子または治療剤を集合的に処理した複数の細胞が存在する顕微鏡視野全体を解析する際に有用です。この解析には、細胞集団に関する情報を効率的に収集するのに十分な低倍率で撮影された画像を使用します。

ImageJで画像を開きます。スケール情報を確認し、測定項目を選択します。面積およびしきい値による制限オプションを選択してください。蛍光ゼラチン画像を用いて分解面積を算出します。その際、背景しきい値を減算してゼラチン全体の不均一な照明を補正し、ピクセル強度の上下限値を設定する画像を使用してください。

以降の画像において、分解領域を選択するための客観的な手段として、しきい値ウィンドウの「set」ボタンを使用し、すべての画像に同一のしきい値を設定します。「analyze particles」機能を用いて、マトリックス分解領域のしきい値を測定します。

選択範囲からノイズを除去するために、0より大きい粒子サイズを選択します。関心領域を特定するために、アウトラインを表示します。その後、描画によってすべての劣化領域が正確に囲まれている場合は、「結果を表示（display results）」と「要約（summarize）」にチェックを入れて測定値を表示させます。

他の物体（デブリなど）が選択されていた場合は、合計面積の測定値をスプレッドシートにコピーし、関連する関心領域の面積のみを記録してください。次に、細胞面積を算出するため、「foid」および染色画像を開き、以降の画像で細胞のエッジが正しく選択されるように、画像の閾値を用いて画素強度の最大値と最小値を設定します。閾値ウィンドウの「set」ボタンを使用して、すべての画像に同じ閾値を設定してください。

細胞領域を選択するための客観的な手段として、「Analyze Particles」機能を使用して細胞領域の閾値を測定します。選択範囲からノイズを除去するため、粒子サイズに0より大きい値を指定してください。

解析領域を特定するためにアウトラインを表示し、表示結果を確認して、面積測定値を表示するために要約します。「チェック」は選択しないでください。細胞とクラスターの間に隙間がある場合は、「穴を含める」を選択してください。

次に、関心領域（ROI）の面積結果をスプレッドシートにコピーし、全細胞面積あたりのゼラチン分解面積を算出します。別の手法として、DAPI染色で核をカウントして決定した細胞数で分解面積を標準化する方法もあります。

操作によって平均細胞面積が変化する場合、この点は重要になります。このアプローチでは、nucleus counterプラグインを使用して核を自動的にカウントします。画像に合わせてオプションを調整し、最適化してください。核が広範囲に重なり合っている場合、自動カウントでは正確な数え上げができない可能性があります。

適切に行えば、セルカウンタープラグインを使用することで手動カウントを効率化できます。カバーガラスには、Oregon Green 488結合ゼラチンを均一にコーティングします。ゼラチンコーティングしたカバーガラスのコーティングおよび処理の過程で、いくつかのアーティファクトが発生することがあります。

例えば、不均一なコーティングは、混合不良、手動での塗布、またはゼラチン混合物の部分的な凝固により、コーティング工程中にカバースリップが適切に覆われなかった場合に起こります。擦り傷は、取り扱い中に針やピンセットで傷をつけることで、コーティングされたマトリックスが除去されたことを示しています。長期保存中にカバースリップ表面が乾燥すると、石畳のような外観になることがあります。この領域は、長時間または高強度の光にさらされたことにより、イメージング中に蛍光ゼラチン表面の光退色が起こったことを反映しています。

適切に準備されたカバーガラスを顕微鏡で観察した際、均一な蛍光を示すことに注目してください。この手順で作成された薄いマトリックスは、細胞のECM分解能を評価するための感度の高い手段となります。例えば。

これらの画像は、OSC 19頭頸部がん細胞による浸潤したポディウムマトリックスの分解活性を捉えたものです。ここでは、Oregon Green 488結合ゼラチンカバースリップ上に細胞を播種し、蛍光顕微鏡を用いて2Dおよび3D画像として撮影しました。Oregon Green 488結合ゼラチンカバースリップ上に播種されたこれらのOSC 19細胞は、Rhodamine結合Phalloidinおよびアンチコルトアクチン抗体で標識され、ANOR 647二次抗体で可視化され、浸潤部位を緑色に擬似着色しています。

マージ画像において、F actinとcortactinが細胞質に局在して凝集している箇所がpodiaとして確認でき、これらはゼラチンの分解領域（clearing volume）と重複しています。可視化により、侵入したpodiaがどのようにECMAサブボリューム内に浸透しているかが示されており、細胞内部で侵入podiaが存在するエッジ部分を表示するためにこのサブボリュームが作成されました。背面のエッジビューでは、下層のゼラチンに挿入された侵入podiaが示されています。

腹側の縁のビューでは、Vedaの歩脚における突出部と、緑色のマトリックスが表示されている領域に赤色として提示されるカバーガラス下のゼラチン分解領域が示されています。これらの画像は、顕微鏡画像全体における正規化されたゼラチンマトリックス分解細胞の定量を目的とした重要な手順のいくつかを示しています。すべての蛍光画像は、赤色のしきい値処理と関心領域（ROI）のマーキングをより明確に表示するために、グレースケールに変換されています。

Oregon Green 488が結合したゼラチンのこの画像は、分解が起こった暗い領域を示しています。ゼラチン画像の閾値処理により、分解領域が強調され、そこから選択した関心領域において分解面積が測定されます。この画像には、期待通りにrumine、foid、およびf actinの染色が示されています。

アクチン画像のしきい値処理により、細胞領域の測定対象を選択するための全細胞領域が強調されます。同様に、この手法はDAPI染色された細胞核の画像解析にも適用可能です。このパネルでは、混合細胞集団内における個々の細胞による蛍光ゼラチンの分解量を定量化するための、主要な手順を示しています。

この単純な定量化は、Flagエピトープタグを融合させた組換えコートアクチンを過剰発現させた単一の形質導入OSC 19細胞を対象としています。形質導入細胞によるマトリックス分解は、形質導入細胞と非形質導入細胞の混合集団内でも分析可能であることに注目してください。この手順を行う際は、いくつかの重要な点に留意する必要があります。

まず、蛍光細胞マーカーが蛍光ゼラチンの色と重複しないことを確認してください。画像を収集する際は、細胞の存在に基づいて視野を選択することが重要です。細胞株による個体差や、さまざまな治療薬への反応性が異なるため、分解領域を優先的に探索するとデータにバイアスが生じる可能性があるため、避けてください。

座席数の減少時間や免疫蛍光標識に使用するタンパク質の選択などの要因は、個々の実験に合わせて最適化する必要があります。このビデオを視聴することで、beta-podia介在性分解アッセイを用いて、蛍光ゼラチンが均一にコーティングされたカバーガラスを作成する方法と、マトリックス分解の定量方法について十分に理解できるはずです。