全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

本手順の目的は、サイクリンBのタンパク質分解が、どのように後期開始および有糸分裂脱出を制御しているかをモニタリングすることです。まず、サイクリンB snapレポーター細胞を顕微鏡スライドに播種します。次に、キメラサイクリンB snapレポーター分子を蛍光基質TMR starで標識します。

次に、顕微鏡ステーションで一連の画像を撮影します。最終ステップでは、細胞を解析し、Cycling Bのプロテオリシス（タンパク質分解）を反映するTMR starの蛍光強度を経時的に算出します。最終的に、生存しているリポーター細胞の免疫蛍光顕微鏡観察により、有糸分裂中に起こるCycling Bプロテオリシスのキネティクスが明らかになります。

cyclone BGFPのモニタリングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、cyclone B SNAPを用いることで、全タンパク質の発現ではなくcyclone Bの分解をモニタリングできる点にあります。本実験に使用するsnapリポーター細胞は、まず対数増殖期において少なくとも48時間非同期的に増殖させます。まず、8ウェルの顕微鏡用チャンバーに細胞を播種するため、サブコンフルエントなsnapリポーター細胞をトリプシン処理し、チャンバーの全表面に均一に分布するように遠心分離して播種します。

10,000個の細胞とResusを、フェノールレッド不含の通常成長培地350 µLに懸濁させます。この細胞懸濁液を顕微鏡チャンバーに移し、チャンバー中央の細胞密度が最大となるように、8ウェルの顕微鏡チャンバーに細胞を播種します。まず、チャンバーにフェノールレッド不含の通常成長培地300 µLを注入します。

次に、96ウェル専用光学プレートのウェル全体に細胞を均一に播種するため、5,000個の細胞を顕微鏡チャンバーの中央に慎重に加えます。必要な細胞含有ウェルの総数に応じて、5,000個の細胞を遠心分離し、300 µLのフェノールレッドフリー通常増殖培地で再懸濁します。細胞数および懸濁培地の総量を調整してください。

次に、細胞懸濁液を96ウェルプレートに移し、ウェル中央に最大細胞密度となるように細胞を播種します。各ウェルの中央に、フェノールレッド不含の通常増殖培地 15 µL に懸濁した 1,500 個の細胞を、小さな液滴として慎重に加えます。

これにより、細胞の増殖をウェルの中心に制限します。染色手順を開始する30分前に、播種したすべての細胞を標準的な細胞培養条件下で少なくとも18時間増殖させます。フェノールレッド不含の通常増殖培地を37°Cに予熱しておきます。

本デモンストレーションで使用するSNAP基質は、取り扱いの容易なTMR starです。TMR starをDMSOに溶解し、濃度400 µMのストック溶液を調製します。このTMR starストック溶液0.5 µLを、フェノールレッド不含の加温した通常増殖培地200 µLに希釈し、最終標識濃度を1 µMにします。次に、非同期的に増殖している細胞から通常増殖培地を除去し、標識培地と交換します。細胞を標識培地中で、標準的な培養条件下で25分間インキュベートします。

25分後、標識培地を除去し、温めたフェノールレッドフリーの通常増殖培地で細胞を4回洗浄します。最後の洗浄後、顕微鏡へ運搬する前に、温めたフェノールレッドフリーの通常増殖培地300 microliters中で細胞を30分間インキュベートします。未結合のsnaps基質を除去するため、培地を新鮮で温かいフェノールレッドフリーの通常増殖培地と交換し、37 degree Celsiusに予熱したヒートブロックを入れた発泡スチロール製ボックスを用いて、細胞を顕微鏡まで運搬します。

蛍光強度の測定を開始する2時間前に、温度変動を最小限に抑えるための準備を行います。マイクロスコープおよびすべての構成部品を目的の温度にするため、クライメートチャンバーの空気温度をドライモードで37 °Cに調整します。結露によるマイクロスコープの損傷を防ぐため、湿度を設定する前に予熱を行うことが重要です。

顕微鏡システム全体が37 °Cに達したら、空気湿度を60%、二酸化炭素濃度を5%に調整します。スキャンまたは収集ソフトウェアを起動し、標準設定を定義します。解析対象となるウェルの位置を指定します。ΔT（または収集サイクル時間）および収集サイクルの絶対回数を定義します。

本デモンストレーションでは、より多くのウェルを解析するためにハードウェアオートフォーカスが事前選択されています。撮影を開始し、最初の2回の撮影サイクルを監視してください。

顕微鏡でhistone H2 GFP信号にフォーカスを合わせ、そのチャネルで1枚目の画像を撮影した後、フィルターを切り替えて対応するTMR star画像を撮影します。この操作を、ウェル内のすべてのポジションおよび検討対象の各ウェルに対して繰り返し、その後次のサイクルへと移行します。タンパク質分解プロファイルを解析するには、scan R解析ソフトウェアを起動してください。

ヒストンH2-GFPによって可視化された細胞核を画像解析し、信号強度に基づく閾値と、隣接する細胞の分離を補助するウォーターシェッドアルゴリズムを用いて、これをメインオブジェクトとして定義します。TMR*解析のために、核と細胞質からなるサブオブジェクトを作成する必要があります。メインオブジェクトの重要な特性は、XおよびY座標、時間、GFPの最大強度および平均強度、ならびに面積あたりの総強度です。

TMR starサブオブジェクトについて、トレースモードに切り替えて、サブオブジェクトの平均TMR star蛍光強度の経時変化、または解析済みのメインオブジェクトに割り当てられた細胞トレースを可視化します。より多くの細胞数を確認することで、代表的かつ客観的な俯瞰が可能になりますが、少なくとも140サイクル持続し、かつヒストンH2 GFP強度の最大値が大きい測定値でゲーティングを行うことで、検討する細胞数を絞り込むことができます。興味のある細胞トレースを選択すると、単一細胞レベルでヒストンH2 GFPとTMR starの蛍光を同時に可視化できます。

右マウスボタンを使用して、目的の細胞をクリックし、エクスポート可能な画像を生成します。各タイムポイントにおけるヒストンH2-GFPおよびサイクリンB-SNAP-TMR*の図説用ギャラリーです。スキャナー解析ソフトウェアのポピュレーションモードに切り替え、ドットプロット上で目的の細胞が表示されている領域をゲートします。

ゲートされた領域に新しいドットプロットウィンドウを適用し、TMR star 蛍光強度の平均値の時間経過に伴う変化を可視化します。さらなる計算を行うため、データを Microsoft Excel にエクスポートします。ここでの図は Cyclin B のキネティクスを示しており、赤色の三角形で示される核膜崩壊（NEBD）後の細胞質凝縮時に染色体不整列の兆候なく通常の有糸分裂を進行する細胞の TMR star 蛍光強度曲線で表されています。TMR star 蛍光強度は、等形ウィンドウに達するまで急激な上昇を示します。

細胞が前中期に入ると、前期的および中期を通過している間は蛍光強度が安定したレベルで維持され、その後急速に低下し始めます。すべての染色体が安定した中期板を形成すると、この低下の後に染色体の分離が起こります。有糸分裂後期の曲線上の青い点で示される後期の間、クロマチンは凝集を解除し始め、細胞は後期特有の形態になります。

蛍光強度の曲線はプラトーに近づきますが、これは有糸分裂が進行する前のプラトーよりも低い値となります。この手法は、有糸分裂分野の研究者が、有糸分裂の進行を制御するサイクリンの分解と合成の緻密なバランスを探索するための道を開きました。