コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

この手順の全体的な目的は、マウスの膵臓からアイレットを正常に単離することです。まず、周囲の組織から膵臓を単離します。次に、胆管にカニューレを挿入し、コラゲナーゼプロテアーゼ混合液で膵臓を膨張させます。

膨張後、膵臓を取り出し、アイレットを慎重に分散させます。最後に、単離したアイレットをろ過し、今後の使用に備えてプレートに播種します。最終的に、精製コラゲナーゼと中性プロテアーゼを用いたこのアイレット単離法により、最大のアイレット収量と最適なアイレット形態を得ることができます。

この手法の既存のアイレット単離法に対する主な利点は、精製酵素を使用することでロット間のばらつきを排除したことです。さらに、アイレットの形態を改善するために、いくつかのプロトコルを変更または改善しました。安楽死させた後、肛門から横隔膜まで腹腔を完全に開く前に、体幹を70%ethanolで覆います。

次に、マウスを解剖顕微鏡のステージ上に置きます。盲腸と上行結腸を引き出し、体腔の外側の左側に配置し、肝葉を横隔膜の方へ押し寄せます。そのままの位置に固定されない場合は、体腔の開口部を広げてください。

曲鉗子で十二指腸を把持し、肝臓に向かう肝動脈、門脈、胆管の束を確認します。別の曲鉗子を用いて、動脈、静脈、および胆管の束の下に縫合糸を通し、可能な限り肝臓に近い位置で締め付けます。

2対の曲型鉗子を用い、慎重に十二指腸を把持して、乳頭に付着している胆管を確認します。鉗子の片方の先端を用いて、胆管の直下かつ乳頭付近にある膵臓および結合組織を突き抜けます。速やかに、その穴に鉗子を通し、縫合糸を緩く挿入します。90度鉗子を使用して、胆管の周囲に縫合糸を小さく円状に結びます。

胆管が張るまで小腸を牽引します。腸を保持しながら、超極細剪刀を用いて、胆管を乳頭から外さないように乳頭を横方向に1回切開します。胆管にカニューレを挿入し、カニューレの周囲の縫合糸をゆっくりと締め付けます。

次に、3 mLのシリンジに2.0 mLのコラゲナーゼプロテアーゼ混合液を満たします。この混合液をゆっくりと一定の速度でカニューレに注入してください。膵臓の膨張が完了したら、胆管からカニューレを抜去します。

下行結腸から始めて、胆管に到達するまで腸を上に引き上げながら、結合組織を切り離します。次に、膵臓を脾臓および周囲の組織から分離します。最後に、縫合糸を切断し、膵臓を取り出します。

摘出した後、膵臓を5 mLのHBSSが入った50 mLチューブに入れ、氷上で保持します。すべてのサンプルの回収が完了したら、膵臓組織の入った50 mLチューブを37 °Cの水槽に入れます。15分間、チューブを緩やかに揺らしながら、組織が解離しているかを確認します。

チューブの蓋を持ち、組織が容易に分散することを確認してください。さらに12回旋回させ、組織をさらに解離させます。HBSSを30 milliliters以下加え、遠心分離を行います。

上清を注意深く吸引しますが、細胞ペレットを乱さないよう、底に少量の超清を残しておきます。14ゲージの針を装着した30 mLシリンジを用いて、10 mL以下のHBSSを加え、懸濁液を2回吸い上げと排出を繰り返します。細胞混合物をプラスチック製Tストレーナーでろ過し、50 mLチューブに回収します。

さらに10 millilitersのHBSSで洗浄し、遠心分離します。上清を捨て、チューブを逆さまにして吸収性のペーパータオルの上で1分間水気を切ります。各チューブを10 millilitersで再懸濁します。

1100で冷却します。不透明なオーバーレイを不透明な状態で、10 millilitersのHBSSとともに遠心分離します。25 milliliterの大口径ピペットを用いて20 millilitersの上清をすべて除去し、その上清を逆さまにした70 micronフィルターに通します。

アイレットをペトリ皿に直接ろ過し、アイレット培地10 millilitersをピペッティングしてフィルター培養液を洗浄します。実験準備が整うまで、アイレットを組織培養インキュベーター内で保持します。アイレットの収量、形態、および品質が、アイレット分離の成功を判断するための一般的な指標となります。

典型的なアイレットの形態をここに示します。アイレットは円形から楕円形の形状をしており、サイズは比較的均一です。ここでは、単離したアイレットを用いて、グルコース刺激性インスリン分泌の解析を行いました。

Sigma Type 11で調製したアイレットとci zyme TM、MABPで調製したアイレットでは、インスリン刺激に差がなく、アイレット調製の質が高いことが示されました。このビデオを視聴することで、マウス胆管のカニューレ挿入方法を十分に理解できるはずです。あらゆるアッセイのために、zymeコラゲナーゼおよびニュートロプロテアーゼを用いてアイレットを分離してください。