二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

この手順の全体的な目標は、2段階のコラゲナーゼ灌流手順を使用してヒト肝細胞を単離することです。これは、最初に灌漑カニューレを使用して肝臓の血管をカニューレで挿入することによって達成されます。これに続いて、コラゲナーゼを使用して肝臓片の灌流と消化が行われます。

3番目のステップは、解離した肝細胞を放出するGlistensカプセルの除去です。最後のステップは、肝細胞を分離する低速遠心分離です。最終的には、位相差顕微鏡法または免疫細胞化学を用いたアルブミン染色により肝細胞を同定し、トライアムブルー排除アッセイを用いて肝細胞の生存率と収量を測定することができます。

この方法は、カニューレ挿入と消化のステップを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。これは、カニューレ挿入にはある程度の技巧が必要であり、消化の完了を特定するのが難しい場合があるためです。この技術に不慣れな人のために、手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるNatalie Lunです。

このデモンストレーションでは、人間のピースの代わりにランプの肝臓を使用し、肝臓ピースの灌流のための機器を次のようにセットアップし、溶液が肝臓に到達するときに摂氏37度になるようにウォーターバスを適切な温度に設定します。切れ。41°Cは、溶液1、2、および3には適しており、ジャケット付きガラスコンデンサー溶液4には、コラゲナーゼ活性の損失を減らすために摂氏37度にする必要があります。滲出の直前にガス調整器をオンにします 病理医からの酸素化装置の場合、理想的には、ほとんどまたは完全に無傷の輝くカプセルと1つの切断面の場所のみを持つ肝臓片を入手してください。

穴あきフィルターディスクを含むBuchner漏斗上のこの肝臓片は、灌流システムは、肝臓片の切断面上の大きな血管にオリーブの先端を持つ低流量インサート湾曲灌漑カニューレを使用して溶液1でプライミングする必要があります。血液が肝臓から洗い流されると、灌流が良好な領域の組織が軽くなります。使用されるカニューレの数は、肝臓のサイズによって異なります。

一般に、20グラム未満から80グラムを超える肝臓には、4〜8本のカニューレを使用する必要があります。カニューレのゲージを選択して、ぴったりとしっかりとフィットします。緩衝液が組織から排出されるように、小さな血管を開いたままにします。

次に、蠕動ポンプの流量を毎分110〜460ミリリットルに増やします。肝臓片が使用される流量全体で明るい色である場合、それは良い灌流です。肝臓のサイズによりますが、より大きな肝臓にはより高い灌流率が使用されます。

一般的に言えば、カニューレあたり毎分44ミリリットルの平均灌流速度は、さまざまな肝臓の重量で理想的です。選択した流量により、肝臓片がわずかにふっくらするはずです。灌流中は、生理食塩水に浸したガーゼで覆うことにより、肝臓片を湿らせておきます。

組織に1リットルの溶液を灌流した後、肝臓片に残っている血液を洗い流します。灌流液を溶液2に交換し、10分間灌流します。次に、灌流液を溶液3に切り替え、半リットルで灌流します。

次に、灌流液をコラゲナーゼを含む溶液4に変更します。この灌流を、9〜12分間、または肝臓が十分に消化されるまで、再循環方式で実行します。肝臓組織は、光沢のあるカプセルの下でわずかにバラバラに見えるはずです。.

肝臓はまた、メスの鈍い面で調べると柔らかく感じるはずです。過剰消化は肝細胞の生存率を低下させる可能性があり、消化不足は肝細胞の収量を低下させる可能性があるため、肝臓片を正しい時間消化することが重要です。まず、蠕動ポンプをオフにし、肝臓片からカニューレを取り外します。

次に、100〜200ミリリットルの溶液が入った結晶化皿に組織を置きます。5。Glistensカプセルを慎重に取り出し、細胞をやさしく振り落とします。灌流が不十分な領域がある場合は、メスを使用してこれらの領域を切り取り、中に含まれる細胞を放出することができます。

プロセス中に必要に応じて5液を追加し、最終的には5液の量を500ミリリットルにします。次に、セル懸濁液を2回フィルタリングします。まず、210ミクロンのナイロンメッシュを介して細胞をろ過し、1リットルの円錐形フラスコに入れます。

次に、70ミクロンのナイロンメッシュを介して細胞をろ過し、1リットルの円錐形フラスコに入れます。2つの等量の細胞懸濁液を200ミリリットルの遠心分離チューブに注ぎます。次に、ろ過した細胞懸濁液を72 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

スナットを吸引し、細胞ペレットを約200ミリリットルの溶液に穏やかに再懸濁します。5。遠心分離と再懸濁液を3回繰り返し、最終遠心分離後、細胞を低温保存溶液に再懸濁して、1ミリリットルあたり2〜500万の肝細胞の最終濃度にします。トライアムブルーアッセイは、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を正確に測定するために使用できます。

ここに示されているのは、648の単離からのトライアンブルー染色された肝細胞です。単離されたヒト肝細胞の平均生存率は77プラスマイナス10%でした肝細胞の平均収量は、免疫蛍光法による肝臓のグラムあたり13プラスマイナス1100万の肝細胞でした。アルブミンに対して緑色で陽性に染色された単離された肝細胞の純度は94±1%で、肝細胞の純度を決定しました。

免疫蛍光染色は、1試験につき5回の繰り返しで4回実施しました。位相差顕微鏡法は、肝細胞の大きな細胞サイズや多角形の形状など、肝細胞の形態学的特性を示します。このビデオを見れば、2段階のコラゲナーゼ灌流法を用いてヒト肝細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。