ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

本実験の目的は、生物学的に重要な脂質小胞の堅牢な調製方法を提示することである。これは、リン脂質をガラスバイアルに混合・移送し、水性バッファーで水和させることで多層小胞（MLV）懸濁液を作成することにより達成される。第2段階として、凍結融解法を行い、これにより多層小胞から単層小胞（ULV）を生成させる。

次に、決定した最適圧を用いてリポソーム懸濁液をエクストルーダーに通し、目的のサイズの均質な脂質小胞を作製します。動的光散乱法およびナノ粒子トラッキング解析に基づき、一貫したサブミクロンサイズの小胞が得られるという結果が得られました。超音波処理や沈降法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、最適に決定された窒素流量を持つ圧力制御システムを使用することで、効率的な脂質小胞サイズの調製が可能である点にあります。

この手順を開始するために、テフロンライナー付きキャップを備えた20 milliliterのガラスバイアルを用意し、コンタミネーションを防ぐため、使用前にすべてのガラス器具とシリンジをクロロホルムで洗浄します。250 microliterの気密ガラスシリンジを用いて、試薬グレードのクロロホルム100 microlitersをガラスバイアルに移します。次に、100 microliterの気密ガラスシリンジを用いて、同じガラスバイアルに試薬グレードのメタノール30 microlitersを加えます。

10 mg/mLのPop Cを216 µL、10 mg/mLのPop Eを42 µL、および11 mg/mLのコレステロール溶液を20 µL、20 mLのガラスバイアルに移し、2 mMのPop C/Pop E/コレステロール脂質溶液を調製します。バイアルの底に脂質の薄膜が観察されるまで、低流量のアルゴンまたは窒素ガスを用いて有機溶媒を蒸発させます。蓋を外した状態のガラスバイアルを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間静置します。

残留溶媒を除去するため、あらかじめ0.2 micronフィルターでろ過したバッファーを2 mLガラスバイアルに移し、脂質を水和させます。混合物を4 °Cで一晩インキュベートし、リポソームサイズが30 to 100 nmの場合は48時間以内に使用してください。リポソーム懸濁液を液体窒素中で15秒間凍結させます。

次に、ヒーティングブロックを用いて42 °Cで約3分間、リポソーム懸濁液を融解させます。この凍結融解プロセスを合計5サイクル繰り返します。凍結後に融解させることで、マルチラメラベシクルから単層ラメラベシクルが生成され、エクストルージョン時の脂質トラップ効率が向上します。

次に、Avastinの指示に従い、Lipo So Fast LF 50エクストルーダーを慎重に組み立てて、押し出しの準備をします。窒素の漏れは所望の流速に影響するため、正しく組み立てることが極めて重要です。確実に成功させるために、以下の手順を慎重に行ってください。

気密シールを作成します。大孔径サポートスクリーンをサポートフィルターベースに配置し、続いて円形センターディッシュ、ドレインディスク1枚、ポリカーボネートメンブレン1枚を順に配置します。メンブレンの上に小型の黒色Oリングを置き、サポートフィルターベースに固定します。

4つの対応する穴に4本のネジを締めて、トップフィルターエクストルーダーを取り付けます。フィルターエクストルーダーユニットを大型エクストルージョンバレルの下に組み立てます。エクストルージョンバレルの上にあるシリンダーバレルにリポソーム溶液を加えます。

大きな円形Oリング、狭いキャップ、大きな円形Oリング、および円形キャップを配置します。ガスレギュレーターをエクストルーダーバレルの上部に取り付け、圧力放出バルブを含むすべてのバルブを閉じて空気漏れを防ぎます。エクストルーダーフィルターユニットの下に、20 milliliterのガラスバイアルまたは50 milliliterのエルレンマイヤーフラスコを配置します。

レギュレーターには安全弁が接続されており、圧力が600 PSIを超えると放出されます。窒素ガスをオンにし、エクストルーダーに接続されたガスバルブを開きます。窒素圧を、400 nmのリポソームの場合は25 PSIに、100 nmのリポソームの場合は125 PSIに、30 nmのリポソームの場合は400から500 PSIに上昇させます。窒素によって押し出され、リポソーム懸濁液が容器内に排出されるまで観察します。

液体が見えなくなるまで窒素を流し続けます。エクストルーダーフィルターを通してガラスバイアルに移し、DLS分析を行います。まず、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した20 µMのリポソーム溶液を50 µL準備します。

次に、電源とランプ光源をオンにします。Dynaproソフトウェアを起動してください。目的のサイズのリポソームを検出できるよう、ソフトウェアをアルゴリズムモデルに設定します。

ハードウェアに接続した後、14 µLのリポソーム試料を石英キュベットにピペッティングしてセルホルダーに挿入し、スタートボタンを押します。約20〜30回のデータ取得後、ストップボタンを押してください。ヒストグラムに記録されたリポソーム平均径のピークを分析します。ナノ粒子トラッキング解析は、PBSに溶解させた500 µLの0.1 µMリポソーム溶液の調製から開始し、サンプルコンパートメントを水とエタノールで洗浄します。

次に、糸くずの出ないペーパータオルでサンプルコンパートメントを拭き取ります。レーザー電源とコンピューターの電源を入れ、0.1 molarのリポソーム溶液300 µLをサンプルコンパートメントに注入します。温度制御機能とナノ粒子トラッキング分析ソフトウェアを起動してください。

キャプチャボタンを押してレーザーを点灯させます。水平および垂直調整を用いてステージを移動し、顕微鏡のフォーカスを調整します。任意の温度と記録時間を設定してください。

録画ボタンを押し、指定した時間、リポソーム粒子の静止画を複数枚撮影します。各粒子の動きを追跡し、ヒストグラム上のリポソーム径に対応するピークを分析します。DLSは、散乱光を収集して粒子径を決定する確立された手法であり、リポソームのサイズを決定するために実施しました。

水和リポソームを、書面によるプロトコルに従い、さまざまなサイズと圧力でポリカーボネート膜を用いて押し出し（エクストルージョン）した。DLSで測定したリポソームの直径は、孔径30 nmの場合 66 ± 28 nm、孔径100 nmの場合 138 ± 80 nm、孔径400 nmの場合 360 ± 25 nmであった。

校正標準として50 nmの研磨済みIreneビーズの懸濁液を使用し、その直径は47 ± 16 nmと記録されました。多分散率（% poly dispersity）は、リポソームのサイズに重複がないことを示しています。DLS解析では、装置が大きな粒子に偏るという既知の特性があるため、30 nmより大きな直径が観察されるのが一般的です。

このような装置上の制限があるにもかかわらず、検量線は線形相関を示しています。ナノ粒子トラッキング解析（NTA）は、粒子の屈折率や密度に依存せず、液体媒体中での拡散を直接観察することで各粒子のサイズを測定する新しい技術です。この高解像度技術は、DLSによるリポソームの測定を補完するために使用でき、校正に用いた100 nmおよび400 nmの2種類のポリスチレン溶液に対し、NTAではそれぞれ95 ± 48 nmおよび356 ± 51 nmの直径が記録されました。

脂質溶液はDLSと比較してより整合性のある直径を示し、平均粒子径は30 nmの孔径では29 ± 14 nm、100 nmの孔径では95 ± 17 nm、400 nmの孔径では359 ± 73 nmであった。NTAはその感度により50 nmから1000 nmの粒子を測定できるため、微小粒子の定量においてより汎用的な特性評価手法となり得る。検量線は、ポリカーボネート膜の孔径と記録されたNTA直径との間に線形相関があることを示している。ネガティブ染色透過電子顕微鏡画像では、エクストルージョン後の各リポソームサイズ（300 nm、100 nm、400 nm）が、互いに明確に区別できることが示された。

倍率を25,000倍に設定し、スケールバーは0.5 µmを示しています。3種類のサイズのリポソームを用いてタイムコース実験を行いました。エクストルージョン直後に、各リポソーム溶液のDLS測定を実施しました。

すべてのリポソーム溶液は4 °Cで一晩保存した。一晩のインキュベーション後、DLSを用いて再度その直径を記録した。60時間のインキュベーション期間後、変化はほとんど、あるいは全く観察されなかった。この手順を行う際は、エクストルージョンフィルターを複数回通過させることで、リポソーム溶液の均質性が向上することを留意しておくことが重要である。

また、クロロホルムによるポリプロピレンチューブからの溶出による汚染を防ぐため、試料調製にはガラスバイアルとシリンジを使用してください。