腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

本手順の目的は、3D培養された細胞を間質液流にさらし、細胞浸潤に対する流体介在性の影響を定量化することです。まず、1型コラーゲンとMatrigelからなるゲル溶液を調製します。次に、規定濃度の細胞をゲル溶液に添加します。

次に、細胞懸濁液を直径12 mm、孔径8 µmのトランスウェルに加え、マトリックスがゲル化するまで37 °Cでインキュベートします。アッセイセットアップの最終ステップとして、静止条件およびフロー条件を作成するために、規定量の培地をトランスウェルに加えます。24時間後、トランスウェル膜を固定し、染色して可視化し、浸潤細胞数を定量します。

マイクロ流体デバイスや間質流チャンバーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ポンプや特殊な装置を必要とせず、研究者が複数の条件や処理を容易かつ迅速に検証できる点にあります。本手法は細胞の遊走や浸潤に関する知見を提供できるだけでなく、タンパク質発現、細胞増殖、細胞シグナル伝達の変化など、他の関連する細胞挙動に対する間質液流の影響を研究するためにも利用または適用することが可能です。本手順の提示にはLIMA two chaaを用います。

私の研究室の大学院生が、4 °Cの氷上でMatrigelの少量を分注することからこの手順を開始します。次に、PBS滅菌水、水酸化ナトリウム、Matrigel、およびラット尾由来 type I collagenを用いてゲルの処方を調製します。その後、氷上でこれらのゲル構成成分を同じ順序で混合し、最終溶液を4 °Cで1時間インキュベートします。

次に、滅菌済みのピンセットを用いて、直径12 mmの8 µポセル培養インサートを12ウェルプレートに配置します。その後、細胞数を計測し、無血清培地で5×10⁶ cells/mLの濃度に再懸濁させ、細胞懸濁液100 µLをゲル溶液900 µLに加えます。その後、ピぺッティングで静かに上下に混ぜ合わせ、十分に混合させます。

続いて、最終混合液を150 µLずつ各インサートに加えます。その後、ゲルが重合するまで、インサートを37 °C、5% CO2 インキュベーター内で30分間静置します。静止条件下では、ゲルの上に無血清培地を100 µL、インサートの下に1,200 µL加えます。

ウェル内のインサートの内外の液量はほぼ等しくし、ゲル全体の圧力差を最小限に抑え、間質流が生じないようにします。流動条件にする場合は、インサートの下に100 µL、ゲルの上に650 µLの無血清培地を添加してください。その際、インサートの下に気泡が入らないように注意してください。気泡があると、その部分で細胞がメンブレンを通過して遊走できなくなります。

その後、プレートを37 °C、5% CO2インキュベーターに24時間置きます。このステップでは、インサートを洗浄するため、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1× PBSを500 µLずつ加えます。次に、フロートレンドウェルの上部に残っている培地を除去します。

次に、綿棒を用いてインサートからゲルを除去します。膜の表面上部を拭き取り、非VA細胞を除去してください。その後、1×PBSが入った24ウェルプレートにインサートを15秒間浸し、洗浄します。

その後、PBSを除去し、各インサートの下に4%パラホルムアルデヒドを500 µL加えます。透過移動した細胞を固定するため、室温で30分間インキュベートします。次に、PFAを除去し、500 µLのPBSで1回洗浄して、残留した固定液を取り除きます。

次に、インサートの下に0.5% Triton X 100溶液を500 µL加え、室温で10分間インキュベートします。細胞を透過させるため、カミソリを使用してインサートからメンブレンを切り出します。その後、1× PBS溶液に溶解した2 mg/mL DPI 100 µLの中にメンブレンを入れます。

メンブレンの下面を下に向け、慎重に配置します。DPI溶液は使用の数分前に調製し、遮光保存してください。次に、プレートをアルミホイルで包みます。

これをシェーカーに載せ、室温で 150 RPM で 30 分間振盪します。次に、メンブレンを 500 µL の PBS で 1 回洗浄し、再びシェーカーで 10 分間振盪します。遊離した jy を除去するため、この洗浄操作をさらに 2 回繰り返します。

次のステップでは、膜をガラススライドの上に、透過した細胞が上を向くように配置します。膜に封入剤を滴下します。その後、カバーガラスで覆います。

その後、核に対するDAPI染色の数を数え、付属の原稿に従って浸潤細胞数を算出します。この図は、メンブレン上の経細胞移動したMDA-MB-435S細胞を示しています。浸潤細胞は、間質液流浸潤アッセイ後に固定され、浸潤細胞のカウントを容易にするためにDPIおよびAlexa Fluor 488結合フィブロネクチンで染色されました。

こちらは明視野下の膜であり、ここにDAPI染色された核が示されています。Alexa Fluor 488 phalloidinで染色されたF actinをここに示します。このグラフは、MDA-MB-435転移性メラノーマ細胞の浸潤が、間質流によって有意に促進されたことを示しています。

24時間後、結果を静止浸潤条件の平均値で正規化し、6つの細胞培養インサートの平均値を提示します。条件間の差は、P値0.003で統計的に有意です。習熟すれば、間質液流アッセイは2時間でセットアップでき、その後24時間のインキュベーションを行い、さらに2時間でトランスウェル膜の固定および染色を行うことができます。

この手順に従うことで、細胞、タンパク質、または核酸を容易に抽出でき、間質液流に反応して遺伝子およびタンパク質の発現がどのように変化するかといった追加の疑問を検証することが可能です。開発以来、本法は間質流ががん細胞に及ぼす影響を研究する研究者にとって不可欠なアッセイとなっています。