オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

このビデオの目的は、血管内皮細胞の炎症状態を特性評価するためのラボオンチップ技術を実演することです。まず、ヒト大動脈内皮細胞を組織培養基質上でコンフルエントになるまで培養し、次にConanプレートせん断装置に挿入します。細胞を前炎症性サイトカインであるTNF alphaで処理し、同時に、基質上のコーンの回転を精密に制御することで、4時間にわたって異なるせん断応力条件下にさらします。せん断応力は、サイトカインに対する十分に特性評価された炎症反応を調節します。

これには、VCAM-1やICAM-1などの接着分子の上方制御が含まれます。基板を顕微鏡ステージに移動させ、APDMSマイクロ流体デバイスを単層上に直接真空密閉して流路を形成します。活性化した単球性THP-1細胞を前処理したHUVEC上に流すと、細胞接着分子の発現レベルに比例して細胞が結合します。

内皮細胞の炎症状態は、強固に接着したTHP-1細胞の総数を定量することで決定されます。こんにちは、私はシェ・ディバースです。グレッグ・フォスターです。そして、キース・ベイリーです。

私たちはカリフォルニア大学デービス校バイオメディカル工学科のPastor教授とSimon教授の研究室にいます。本日は、内皮機能不全と炎症を定量的に調べるためのラボ・オン・チップ（lab-on-a-chip）ベースの手法について解説します。これらのツールは、代謝ストレスと流体力学的因子の重畳、および内皮炎症フェノタイプの調節や動脈硬化への感受性に関する研究を行うためのプラットフォームを提供します。

本研究では、使用するデバイスを血管模倣マイクロ流路チャンバー（vascular mimetic, microfluidic chambers：VMMC）と呼びます。これらのデバイスを用いることで、アテローム形成血管に似た条件下で、内皮細胞および単球における炎症反応を定量化することが可能です。また、VMMCは、供給量が限られている試薬や材料を少量で利用できる利点があります。

これらは、カスタマイズ可能な多くのレイアウトや形状で構築できるため、非常に幅広いアプリケーションに適しています。本日は、当研究室のラボオンチップアプローチを用いた代表的な実験をご紹介します。ヒト血管内皮細胞単層を、明確に定義されたせん断応力の下でサイトカイン活性化にさらします。

本手法では、血管内皮細胞活性化の機能的読み取り値として、ヒト単球細胞の単層への動員をリアルタイムで定量化するためのVMCの使用法を実演します。旋盤を用いて、100 mmの組織培養ディッシュから3インチの円形基材を切り出します。3インチの基材を蒸留水で洗浄し、70%エタノールに浸漬して滅菌します。滅菌した基材を100 mmのペトリ皿に配置し、乾燥させます。

その後、100 µg/mL濃度のI型コラーゲンとともに室温で1時間インキュベートし、PBSで洗浄します。ヒト大動脈内皮細胞（HA）を650,000 cells/mLの濃度で懸濁します。細胞懸濁液1 mLを、乾燥させたコラーゲンコート基質の上のドロップとして滴下し、均一に広げます。

播種した基質を37 °C、5% CO2 インキュベーターに置き、基質表面に接着させます。1時間後、9 mLのEGM-2増殖培地を加え、細胞を単層で約90%のコンフルエンスまで増殖させます。単層が形成されたら、その後のせん断実験に使用可能な状態となります。血管模倣マイクロ流体チャンバーは、目的のチャネル形状を含むマスターフォーム上にPDMSを流し込んで作製します。

シリコンベースをプラスチック製のウェイボートに注ぎ、次にシリコン硬化剤を重量比10対1の割合で加えます。その後、ウェイボートの側面に触れてプラスチックの破片が混合物に入らないよう注意しながら、PDMSゲルを十分に混ぜ合わせます。フォトレジストマスターをヘキサンで洗浄し、VMMCを成形する準備をします。

次に、PDMS混合液をマスターフォームに注ぎ、真空チャンバーに入れます。チャンバー内で15分間脱気を行うことで、PDMS混合液から空気が除去され、表面に上昇します。

型をチャンバーから取り出し、PDMS表面に軽く空気を吹き付けて、型に残っている気泡を排除します。次に、型にカバーをかけて37 °Cのオーブンに1時間置き、PDMSを硬化させます。凝固したPDMSゲルをオーブンから取り出し、小さなメスを用いてチャンバーの周囲に円形の切開を加えます。

マスターモールドを損傷させないよう、フォトレジスト材料に接触することを避けて、この作業を徐々に慎重に行うことが極めて重要です。19ゲージのルアーロック針を用いて、各チャネルのモールドパンチ入口および出口ポートからマイクロ流体チャンバーを切り出します。さらに、チャネルから離れた位置に真空チューブ用の穴を開けます。

VMMCの準備が完了しました。炎症性サイトカインであるTNF alphaを6 mLのL 15培地にピペッティングし、最終濃度が0.5 ng/mLになるように調製します。ここでは、5%CO2がない環境でもpH緩衝能を持つため、L 15培地をせん断液として使用しています。

次に、培地を滅菌済みの10 milliliter シリンジで吸引し、せん断装置への充填に使用します。その後、コンフルエントな単層細胞を、エタノールで滅菌し、水平出しとコーンギャップ高さの設定を完了させた細胞せん断装置に転移させます。基材をペトリ皿から取り出し、ガラスゲージブロックの上に配置して中心を合わせ、コーンが細胞の直上に位置するようにハウジングチャンバーの底部に慎重に挿入します。

基板は、ゲージブロックの周囲にあるステンレス製ネジを均等に締め付けることで固定します。次に、気泡が混入しないように注意しながら、せん断媒体をチャンバーに注入します。その後、コンピューターを使用して任意のせん断応力プログラムを入力し、マイクロステッパーモーターを起動させます。

ここでは、0 ± 5 dyn/cm²の振動せん断を利用します。4時間後、せん断プログラムを停止します。ゲージブロックを取り除き、基板を慎重にペトリ皿に戻します。

細胞の準備が整い、単球接着アッセイを行うことができます。剪断後、直ちにHA単層を顕微鏡ステーションへ輸送し、VMMCを組み立てます。VMMCを真空ホースに接続し、DI waterに浸してチャネル内に閉じ込められた気泡を除去します。

真空バルブをオフにした状態で、チャンバーを単層の上に慎重に押し当て、真空バルブをオンにします。ここでは、チャンバーの流路内に気泡が混入していないことを確認することが極めて重要です。次に、カルシウムおよびマグネシウムを含むHBSS 80 µLを、19 Gaugeルアーロック針の先端を切断して作成したリザーバーにピペットで注入します。リザーバーの上部を強く押して液を先端から押し出し、それをVMMCの注入ポートに挿入します。

アセンブリ全体を顕微鏡ステージに設置し、顕微鏡カメラとビデオモニターの電源を入れます。10 milliliterのガラス製シリンジをシリンジポンプに装着します。次に、シリンジのチューブをVMMCの出口ポートに接続します。

流速は、チャネル内で1 dyne/cm²のせん断応力が生じるように設定し、その後、シリンジがリザーバーからチャネルを通じて液体を吸引するリフィルモードで動作させます。SDF-1で刺激したTh1細胞は、2 × 10⁶ cells/mLの濃度で懸濁させます。フロー開始から2分以内に、50 µLの細胞懸濁液をリザーバーに添加します。

再び、流れが完全に発達した際に気泡が混入しないよう注意します。ビデオは1秒あたり3フレームで撮影し、データはImage Jソフトウェアを用いて計数します。接着性THP-1細胞は、10秒間に細胞径の0.5倍を超えて移動しないものと定義します。

ここでは、TNF αで刺激し、15 dyn/cm²の定常的な高壁せん断応力または0 ± 5 dyn/cm²の振動せん断応力のいずれかで処理したHA単層へのTHP-1の接着を示すデータを提示します。振動せん断応力で処理したHA単層は、高せん断応力を受けた単層と比較して、3倍高いTHP-1細胞の集積を示しました。本研究では、動脈硬化の根底にある初期炎症イベントへの重要な知見を得るために組み合わせ可能な、カスタマイズ可能なin vitro手法の使用法を実証します。具体的には、明確に定義された流体力学的条件下で、炎症刺激にさらされた内皮細胞および内皮機能不全に関連するアウトカムを定量化します。

VMM CSを使用することで、内皮細胞と白血球の接着相互作用の根底にある特定のメカニズムを検討することが可能になります。また、これらのデバイスは柔軟で安価であるという利点があり、ヒト被験者由来の血清成分など、供給量に限りがある材料の使用に適しています。これらのデバイスを用いた我々の研究には、内皮細胞におけるサイトカイン、脂質、およびRAGEが誘発する炎症の調査が含まれています。

また、全血および複数の白血球種における接着メカニズムを調べるオンチップアッセイも開発しました。最終的に、この技術が、炎症を介した心血管疾患の個々のリスクを評価するex vivoアプローチにつながることを期待しています。