ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

この手順の全体的な目的は、野生のケムシから血球を抽出、可視化し、計数することです。まず、ケムシを氷の上に置いて麻酔をかけ、抗凝固剤を含む緩衝液を注入した後、抽出前に血球が再び循環系に戻るようにケムシを氷の上に置くことでこれを達成します。次のステップでは、清潔なメスを使用してケムシの後端に浅い切開を加えます。

次に、柔らかいピンセットを用いて、イモムシを優しく絞ります。その後、マイクロピペットを用いて緩衝液と血リンパ液の混合物を吸引し、マイクロ遠心チューブに回収します。最後に、血リンパ液を等量の緩衝液で静かに混合し、その溶液を10 µL、ヘモサイトメーターに移して、血球を可視化し、その数を計測します。

最終的に、この血球抽出法は、さまざまなイモムシ種の血球数を迅速かつ効果的に測定する方法として、また昆虫の細胞性免疫応答の生理学的側面を調べるためのツールとして活用できます。本手法の主な利点は、前胸背板が非常に小さいイモムシからも血球を抽出できることです。他のイモムシモデルでは、前胸背板のいずれかを切断して出血させ、流出した液体から血球を抽出します。

さらに、この手法は他の昆虫種から血球を抽出するためにも利用可能です。本手法を用いることで、食事の質、発生段階、あるいは異なる病原体への曝露によって昆虫の細胞性免疫応答がどのように変化するかなど、エコイムノロジー（生態免疫学）分野における重要な疑問を明らかにすることができます。本手順を開始するには、血球抽出の20分前に、氷上で冷却して次々回齢幼虫を麻酔してください。

その後、清潔な16ゲージのキャピラリーニードルの鈍端を、20 milliliterのガラスシリンジに接続されたチューブに装着します。回収溶液の入ったチューブは、ラボベンチの上に開いたままにしておきます。キャピラリーに約10 to 15 µLのバッファーをゆっくりと満たします。

その後、解剖顕微鏡の横に配置した粘土の塊の上に針を固定します。イモムシをペトリ皿に入れます。球形構造がはっきりと見えるように、昆虫を横向きに配置してください。

解剖顕微鏡で観察しながら、ピンセットでイモムシを固定し、昆虫のクチクラが一般的に柔らかい球状の部分の近くに針を配置します。次に、毛細管針を昆虫の体にそっと押し当てます。針がクチクラを貫通したら、溶液の全量をイモムシに注入します。

注入後、イモムシの体は膨らみますが、破裂したり液が漏れ出したりしてはいけません。イモムシを冷却したペトリ皿に戻します。緩衝液が傷口から漏れ出すのを防ぐため、昆虫を背側にして配置してください。

hemo limp抽出に使用した各イモムシに対して、同様に注入を繰り返します。その後、すべての昆虫を氷上で30分間冷却します。次に、イモムシをシャーレに入れ、解剖顕微鏡下に配置します。

滅菌済みのメスを用い、腸やその他の内部器官を傷つけないよう注意しながら、イモムシの後方領域に2〜3 mm程度の浅い切開を加えます。次に、柔軟なプラスチック製ピンセットでイモムシを軽く絞りながら、10 µLのピペットチップを用いて血リンパ混合液を約10〜20 µL回収します。ここでも、内部組織を傷つけないよう注意してください。

その後、イモムシの死骸を廃棄します。各イモムシから採取したヘモリンフを、個別にラベルを貼ったシリコン処理済みの0.5 milliliterマイクロ遠心チューブに回収します。次に、個々のイモムシから回収した各ヘモリンフサンプルに、インキュベーション溶液を約10 to 20 microliters加えます。

このステップでは、血リンパサンプルを常に氷上で保持してください。血球数を計測する直前に、血リンパサンプルとインキュベーション溶液を混合してください。

この処理により、血球が適切に分離され、凝集が防止されます。清潔なピペットチップを使用して、インキュベーション溶液と混合した血リンパサンプル10 µLをヘモサイトメーターに分注します。次に、光学顕微鏡を用いて、ヘモサイトメーターの中央グリッドにある大きな正方形のうち、少なくとも15箇所の血球数を計測し、記録します。

これらの値を合算し、15区画における血球数の総和を求めます。次に、蒸留脱イオン水の洗浄ボトルを用いて、血球計数器とそのカバーガラスを十分に洗浄します。その後、キムワイプで水分を拭き取ります。

残りのhemo limpサンプルの手順を繰り返し、イモムシごとのhemo limp体積1mLあたりのhe cytesの平均数を算出します。明視野顕微鏡画像は、nucle hin aiイモムシから抽出したhe cytesを20倍で拡大したものです。この手順に従って回収したhe cytesは、細胞性免疫応答の研究や、食作用、cap、選択的封入、pHオキシダーゼ活性などのアッセイのセットアップに使用できます。

さらに、昆虫におけるこれらの細胞性免疫応答を研究するために、未使用のRNA、DNA、およびタンパク質を回収してさらなるアッセイに使用することができます。このビデオを視聴することで、血リンパを抽出するための毛虫への注射方法と、生存している血球を含む血リンパの回収方法について十分に理解できるはずです。