の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ

本手順の主な目的は、形態学的な観察のみでは区別できないRetta cylindrica（一般にゴングラスと呼ばれる）の品種を分化させることができる、費用対効果が高く迅速な分子ジェノタイピングプロトコルを提供することです。これは、まず目的とするゴングラス品種から組織を特定して分離することによって達成されます。次のステップは、採取した組織から核DNAおよびプラスミドDNAを抽出することです。

次に、抽出したDNAを用いて、PLAs turn LF領域の配列差を標的とする品種特異的プライマー、および適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行います。最終ステップとして、4つのPCR反応それぞれにゲル電気泳動を行い、増幅されたPCR産物を可視化します。最終的に、ゲル上の品種特異的なPCR産物バンドを解析することで、採取されたゴングラスの品種を判定します。外来植物は米国に年間約34億ドルのコストをもたらし、農業資源と天然資源の両方に甚大な被害を与えています。

野生型のimparato Electrica（コガングラスとしても知られる）は、世界で最も深刻な侵略的雑草トップ10の一つです。コガングラスは単一の群落を急速に広げ、在来植生を置き換え、その結果、その在来植生に依存する動物類にも影響を与えます。現在、この草は世界中で4億9,000万ヘクタール、米国では約50万ヘクタールにわたって分布しています。また、ti of tus centricaの観賞用品種は、tus Centrica、Arbra、red Baren、そして本稿ではJBGと呼ぶJapanese blood crassなどの名称で広く市販されています。この品種は推定上の不妊性で非侵略的であり、その赤い葉が好ましいと考えられています。

特定の条件下では、ジャパニーズブラッドグラスは生存可能な種子を生成し、野生型のコガングラスと区別がつかない全緑色の形態に戻ることがあります。見ての通り、どちらも緑色の葉を持ち、従来の観賞用品種よりも大きく、葉もより広くなっています。さらに、戻り咲いた個体と野生型の個体は根茎がより大きく、観賞用品種は無性生殖の能力を高めています。

形態学的特徴のみによる同定は、困難な作業となります。分子生物学的な手法を用いることで、通常の視覚的な手段では同定不可能な侵入植物や植物材料を正確に区別することが可能になります。

外来植物の拡散と導入を防ぐためには、分子生物学的手法が不可欠です。この分子プロトコルを適用することで、Japanese blood grassの戻り交雑個体とKogan grassを正確に区別することが可能になります。本プロトコルは、Kogan grassとの共存および、生存可能なハイブリッドが形成される可能性を防止するのに役立ちます。

増幅断片長多型（AFLP）分析やDNAシーケンシングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、野生型のコガン grassとJapanese blood grassの品種との違いを容易に判別できる、非常に費用対効果が高く迅速な分子ジェノタイピング手法を提供できる点にあります。この手法の実演は、当研究室の学部生のJoseph Heryが行います。まず、コガン grassまたはJapanese blood grassが生育しており、それらを互いに区別する必要がある地点から検体を採取します。

日本血之草（Japanese blood grass）は、その鮮やかな赤色の葉により、野生型のコガネスゲ（Kogan grass）と容易に区別できます。しかし、日本血之草のリバート（revert）は、観賞用の日本血之草よりも葉が長く、葉面積が広く、根茎が大きいため、コガネスゲとほとんど見分けがつきません。本手法は、新鮮な葉組織、冷凍組織、および最近乾燥させた葉組織に使用可能です。

DNA抽出のために組織を後日で保存する場合は、直ちに-80°Cで凍結保存する方法が最適です。乾燥保存が必要な場合は、組織を紙封筒に入れ、その封筒を室温で脱水シリカゲルまたはその他の活性乾燥剤と共に保存してください。新鮮な組織を使用する場合は、分解を防ぐため、採取から3時間以内にDNAを抽出するようにしてください。

本手順では、メーカーの指示に従い、Kyogen社のDNEZ plants mini kitを使用しますが、1か所のみ軽微な変更を加えています。本手順は、100 mg以上の新鮮または凍結組織、あるいは20 mg以上の乾燥組織を使用するように最適化されています。まず、冷却した乳鉢と乳棒を用い、液体窒素で3回冷却しながら、100 mg以上の新鮮または凍結葉組織、あるいは20 mg以上の乾燥葉組織を微粉末状に粉砕します。

新鮮または冷凍組織から得られた凍結粉末を、100 mgずつ分注して計量します。乾燥葉組織を使用する場合は、粉末を20 mgずつ分注して計量してください。この後、製造元の指示に従ってDNA抽出を行い、NanoDrop分光光度計などの分光光度計を用いてDNAの品質および量を測定します。良好なDNA収量は50～150 ng/µLであり、260/280および230/280の比率が、ここに示されるように2.0に近い値となります。

標準的な1%AROSゲルを用いて電気泳動を行います。10 KB以上の比較的大きなバンドが存在することを確認してください。RNA混入によるストリーキングがほとんどないか、全くないことを確認し、DNA濃度が高い場合は、以降のステップのためにサンプルを70 nanograms per microliterに希釈してください。このプロトコルで使用されるPCRプライマー（赤色と緑色の矢印で表示）は、Cogan grassとJapanese blood grassのジェノタイプ間におけるplastered turn LFスペーサー領域の配列差に基づいています。

これらの相違点は、垂直の黒い矢印で示される一塩基多型（SNP）および挿入・欠失の形式で現れ、これにより品種特異的プライマーの開発が可能になります。ユニークな配列部位にプライマーを配置することで、各分離DNAサンプルに対するプライマー配列はプロトコルの記載部分に記載されています。記載されたプロトコルに従い、各プライマーセットを用いて、0.2 mLの薄壁PCRチューブ内で2つの50 µL PCR反応系を氷上で調製してください。DNA濃度が低い場合は、合計反応容量が50 µLに維持されるようにヌクレアーゼフリー超純水の量を調整し、各反応にDNAをさらに添加することができます。

DNAサンプルに含まれる不純物がPCR反応を阻害する可能性があるため、1反応あたり5 µLを超えるDNA、または全容量の10%を超えるDNAを使用しないでください。すべてのPCR試薬が正常に機能しているか確認するため、ポジティブコントロールを適切に設定します。ポジティブコントロールと同じプライマーセットを使用し、抽出したDNAの代わりに2回蒸留水を用いてネガティブコントロールを設定します。この時点で、テストする各サンプルにつき合計4つのPCR反応が設定されます。次に、加熱リッドを備えたサーマルサイクラーを用いてPCR増幅を行います。PCRサイクリングパラメータは書面の手順に従ってください。DNA、プライマー、Taq polymeraseの品質や、使用するサーマルサイクラーの種類によっては、アニーリング温度、伸長時間、サイクル数の最適化が必要になる場合があります。

PCR反応が完了したら、標準的な電気泳動法を用いて、1%ゲルでPCR産物を分離します。DNAフロントがゲルの全長3/4に達するまで、約120Vでサンプルを泳動させます。UVライト下でゲルを可視化し、得られたバンドを確認して、適切なDNA断片が増幅されたかを確認してください。

この代表的なゲルは、コガン grass、Japanese blood grass、およびJapanese blood grass revertのDNAサンプルに、コガン grassおよびJBG特異的プライマーを組み合わせたPCR産物の電気泳動結果であるとともに、turn LF陽性コントロールおよびテンプレートなしの陰性コントロールの結果を示しています。turn LF陽性コントロールのプライマーセットは、コガン grass、Japanese blood grass、Japanese blood grass revert、およびその他のイネ科植物に対して同様に機能し、890 base pairsのバンドが得られます。すべてのPCR試薬にDNA汚染がない場合、陰性コントロール反応ではPCR産物は得られません。

DNAサンプルが野生型のコガン grass由来である場合、コガン grass特異的プライマーセットを用いたPCR反応では約595 base pairsに単一のバンドが現れ、JBG特異的プライマーではバンドが現れません。同様に、DNAサンプルがJBGまたは戻りJ-B-G-A-P-C-R反応由来である場合、JBG特異的プライマーセットを用いると約594 base pairsに単一のバンドが現れます。一方で、コガン grass特異的プライマーではバンドが現れません。

JBGおよび戻り交雑JBGは核酸配列が同一であるため、バンドパターンも同一になります。しかし、JBGと戻り交雑JBGの形態的な違いは極めて明白であるため、PCRの結果は同じになりますが、植物レベルでJBGの系統を容易に区別することが可能です。PCR産物のDNAシーケンシングを行うことで、異なるコガングラスのエコタイプにおけるDNA配列の潜在的な変化を特定できます。

本技術の開発により、野生型の K and grass と、その観賞用品種である Japanese blood grass の回帰型を正確に区別できる、初の簡便な分子生物学的手法が提供されました。本プロトコルの利用者が、得られた結果を報告するために当研究室へ連絡することを推奨します。共有された情報は、Japanese blood grass の分布に関する知見を得るのに役立ちます。

これはまた、USDAの規制当局が、極めて侵略性の高いコガン grass（Cogan grass）品種の拡散と潜在的な交雑を回避するために必要となる措置について、十分な情報に基づいた決定を下す際にも役立ちます。