アミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインの精製と集約

本手順の目的は、A$\beta$ ICDとしても知られるアミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインを精製し、原子間力顕微鏡を用いたA$\beta$ ICDの熱凝集および特性評価のプロトコルを提示することである。まず、細菌においてA$\beta$ ICDのA$\beta$ GST融合タンパク質を発現させる。次に、GST-A$\beta$ ICDタンパク質を精製し、トロンビンで切断してGSTをA$\beta$ ICDから分離させ、GSTを除去する。

次に、A ICDの熱凝集を誘導します。最後に、原子間力顕微鏡を用いてA ICD凝集体のイメージングを行います。最終的に、A ICDを生化学的および生物物理学的解析に十分な量で均一に精製できることが示されます。

複雑なクロマトグラフィー工程を必要とする既存の手法と比較した本手法の主な利点は、高純度で可溶性のICDを、標準的な試薬と装置を用いてベンチトップで単離できることです。本プロトコルで精製されたICDは、その後の生化学的および生物物理学的特性解析に適しています。

手順の実演はAmina tiが行います。私の研究室の元ポストドクターであるAndres Oberer博士が、A ICDの原子間力顕微鏡イメージングの作製方法を実演します。組換えA PP細胞内ドメイン（A ICD）を発現させるには、まず、GSTのC末端にヒトA ICDを融合させたpgx 41ベクターを導入したBL 21細胞を用います。単一のコロニーを用いて、アンピシリンを含む10 millilitersのLB培地に接種し、37 °Cで激しく振盪しながら一晩培養します。

1Lフラスコに入れた400mLのLBアンピシリン培地に、5mLのオーバーナイト培養液を接種してインキュベートします。600nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.4から0.6に達するまで、37°Cで激しく振盪しながら培養します。通常、G-S-T-A-I-C-Dの発現誘導までには2〜2.5時間かかります。

0.4 mMのIPTGを添加し、37 °Cで激しく振盪しながら5時間インキュベートします。細胞を4 °Cで15分間、6,000 ×gで遠心分離し、ペレットを-80 °Cで保存します。溶解バッファーを調製して細菌を氷上に置いた後、ペレットに20 mLのバッファーを加え、ボルテックスミキサーとピペットを用いた氷上での転倒混和を組み合わせて十分に溶解させます。

細菌ペレットを再懸濁し、再懸濁した細菌ライセートを、あらかじめ冷却したエマルシファイアまたはフレンチプレスに通します。30,000 PSIでライセートを再度エマルシファイアに通し、あらかじめ冷却した50 milliliterチューブにライセートを回収します。ライセートを15,000 ×g、4 °Cで30分間遠心分離します。

上清を分離し、あらかじめ冷却した50 mLチューブに移します。50%グルタチオン・アガローススラリーを500 µL加えます。サンプルを回転させながら、4 °Cで30分間回転させます。

インキュベーション後、新鮮な溶出バッファーを作成します。ライセートとスラリーを、粗いフィルター付きの5インチ使い捨てポリスチレンクロマトグラフィーカラムに注ぎます。カラムを3 mLのPBSで5回洗浄します。

カラムの底部にキャップをし、室温の溶出バッファーを500 µL加えます。カラムの上部にキャップをし、室温で5分間回転させます。初期溶出液を冷却した1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収します。

溶出をさらに2回繰り返します。溶出液を分画分子量 10,000 の透析膜に入れ、4 °C で 4 L の PBS を用いて一晩透析します。翌日、さらに 4 L の PBS を用いて 4 °C で1時間透析します。

透析カセットからタンパク質を取り出し、タンパク質定量アッセイを行い、G-S-T-A-I-C-Dの収量を決定します。400 millilitersの培養液からの典型的な精製では、20 milligrams以上の精製タンパク質が得られ、濃度は10 to 20 milligrams per milliliterになります。タンパク質を200 µLずつ分注し、minus 80 °Cで冷凍保存します。

GSTタグからA ICDを遊離させるために、200 µLの精製G-S-T-A-I-C-Dに、1 unit/µLのトロンビンを20 µL加え、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、4 °Cで20,000 ×gにて30分間遠心分離し、凝集した物質を除去します。GSTおよびトロンビンを除去するため、上清をあらかじめ冷却したマイクロチューブに移します。次に、50%グルタチオンアガローススラリーを50 µL、および50%p wino zaineアガローススラリーを50 µL、それぞれ加えます。

室温で5分間、回転させてインキュベートします。短時間遠心分離してアグロビーズを沈殿させ、上清を新しいチューブに移します。グルタチオンを用いて、さらに4回GSTを抽出します。

精製したA ICD 5 µLを用いてタンパク質定量アッセイを行います。400 mLの培養からの標準的な収量は50〜100 µgで、濃度は0.2〜0.5 mg/mLとなります。調製したばかりのA ICDをPBSで0.1 mg/mLの濃度に希釈した後、加熱シェーカーを用いて43 °C、800 RPMで48時間インキュベートし、熱凝集を誘導しました。

サンプルを脱イオン水で20倍に希釈し、切り出したばかりの雲母の上に2 µLをスポットします。凝集したAβ ICDを可視化するため、サンプルをデシケーター内で一晩乾燥させます。チップの公称半径が2 nmの金コーティングされた鋭い窒化シリコンカンチレバーを用い、タッピングモードで原子間力顕微鏡による観察を行います。

イメージング中の典型的なタッピング振幅は、カンチレバーの共振周波数において 10 to 20 nanometers です。ここで G-S-T-A-I-C-D の発現と相対的な濃縮を示します。溶解後、融合タンパク質の大部分は可溶性分画に存在するため、封入体からの抽出は不要です。

グルタチオン・セファロースカラムから溶出された物質の純度は95%以上でした。ここに示す調製では、カラムから溶出されたタンパク質の濃度は14.5 mg/mLで、収量は22 mgでした。この調製液200 µLを20 unitsのトロンビンで一晩にわたって切断したところ、融合タンパク質はほぼ100%切断されました。

使用したトロンビンの量は、クマシー染色で検出されないほど低濃度でした。青色染色およびトロンビンとGSTの除去により、一部の材料が失われました。しかしながら、純度は90%を超えており、今回の調製におけるA ICDの収量は70 µg、濃度は0.35 mg/mLでした。

FMで撮影されたICD凝集体は、通常、ステロイド様のアモルファス構造であり、サイズは50から100ナノメートルの範囲です。凝集反応に等モル量のシャペロンUBI Quillin 1を添加すると、凝集物質は検出されません。このビデオを視聴することで、EICDを精製し、その凝集を誘導し、A-F-M-E-I-C-Dで凝集体を撮影する方法について十分に理解できるはずです。

この手法で精製されたものは、光散乱法やフィルタートラップアッセイなどの他の手法に適用でき、分子シャペロンがEACDの凝集に及ぼす影響に関する疑問を明らかにすることができます。