三次元異

本実験の全体的な目的は、初期段階の卵巣がん進行の三次元的な典型的モデルを構築することである。まず、原代の正常な卵巣上皮組織および線維芽細胞組織に由来するH turt不死化細胞株を樹立する。次に、卵巣内に存在する生体内の構造および複雑な細胞間相互作用を再現するため、上皮細胞株と間質細胞株を三次元Sスフェロイドモデルで共培養する。続いて、オルガノイド培養物を固定および染色し、特定のマーカーの発現を解析することで、間質・上皮相互作用の分子的な特徴を研究する。

得られた結果は、3D擬似モデルの基質細胞コンパートメントにおける改変が、共培養された上皮細胞の表現型にどのように影響を与えるかを示しています。3次元擬似モデルは、この疾患の起源の探索や、腫瘍の発生および進展における基質微小環境の役割の解明など、卵巣がん研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。これらの手法の応用範囲は、他の3D培養法と比較して、疾患の診断や治療にまで及びます。

この手法は、より広範な細胞培養量およびダウンストリームアプリケーションに適用可能です。例えば、3Dのホモおよびタイピック培養は、in vitroでの薬剤試験に使用できます。また、このアプローチは、他の固形腫瘍型の研究や良性疾患などの他のモデルシステムにも適用可能です。

新鮮な卵巣組織を、追加の抗生物質と抗真菌剤を添加した不死化正常卵巣線維芽細胞増殖培地を用いて、細胞培養室まで運搬します。組織に緩く付着している上皮細胞を除去するため、サンプルを5 mLのPBSで3回洗浄します。次に、サンプルとPBSを清潔なP100培養皿に移します。滅菌済みの器具を用いて、組織を2枚目の乾燥した清潔なP100培養皿に転移させます。

組織を0.5平方センチメートルの大きさに切り分け、各断片を別々のP 100ディッシュに移します。さらに組織を切り進め、1平方ミリメートル未満の大きさにします。その後、20ミリリットルのINOF GM培地を加え、培養します。位相差顕微鏡を用いて細胞の増殖を観察してください。

24時間以内に細胞がディッシュに接着したことを確認します。位相差顕微鏡を用いて細胞の増殖を観察してください。通常、細胞は24時間以内にディッシュに接着します。1週間後、非接着組織を吸引により除去し、培地を補充します。その後、細胞コロニーの大きさが約500 micronsになるまで、1〜3週間の間、週2回培地を交換してください。

トリップスとコーティング済みクローニングディスクを用いてクローンを単離します。100%線維芽細胞であることを確認するため、細胞株の一部をガラスカバースリップに播種し、線維芽細胞マーカー、上皮マーカー、および血管内皮細胞マーカーを用いて免疫蛍光染色を行います。

H Turtのレトロウイルス導入の1日前に、正常な卵巣線維芽細胞の単離物を単一のP 100ディッシュから3つのP 100ディッシュに分注します。調製済みのウイルス上清は、購入するか、HEK 293T細胞の共同トランスフェクションに関する標準プロトコルを用いて自前で調製することが可能です。poly HEMA溶液を調製するには、1.5 gのpoly HEMAを量り取り、滅菌ボトルに入れます。

分子生物学グレードの無水エタノール 95 mLと、細胞培養グレードの蒸留水 5 mLを加えます。ポリHEMA溶液を65 °Cのウォーターバスに置き、完全に溶解するまで加熱します。調製したばかりのポリHEMA溶液で組織培養皿をコーティングします。

ラミナーフローフード内で、細胞培養ディッシュを風乾させます。大サイズのディッシュやフラスコを均一にコーティングさせるには、ロッキングプラットフォームを用いて緩やかに揺らす方法が有効です。Polyus溶液が速く乾きすぎると、表面が滑らかになりません。

必要に応じて、3D培養前に線維芽細胞の前処理を行います。例えば、細胞老化を誘導する場合は、亜致死量の過酸化水素で細胞を前処理します。3D異所性ステロイドを構築するために十分な細胞数を確保できるよう、INOFおよび上皮細胞の培養物をin vitroで回復させ、拡大培養します。PBSで5分間洗浄した後、poly hemaプレートに15 millilitersの培地を加えます。

その間に、不死化した正常卵巣線維芽細胞にトリプシンを加え、培養皿から剥離させます。3〜5分後、等量の培養培地でトリプシンを中和し、遠心分離によって細胞を回収します。細胞ペレットを5 mLの培地で再懸濁し、ピペッティングまたは緩やかなボルテックスで十分に混ぜ合わせます。

次に、10 µLのサンプルを用いて、トリパンブルーで生存細胞数を計測します。次に、あらかじめpoly-HEMAコーティングしたプレートに分注しておいた培地に、4 x 10⁶ 個のINOF細胞を加えます。培地の総量を20 mLとし、37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。

位相差顕微鏡を用いて、細胞が多細胞ステロイドへと凝集する様子を観察し、2〜3日ごとにSスフェロイド培養の再給餌を行ってください。プレートをピペットに立てかけ、傾斜させた状態で静置します。スフェロイドを沈降させ、5 mLピペットを用いて、使い切った培地を約16 mL慎重に除去します。

7日目に、16 millilitersの新鮮な培地を培養液に加え、インキュベーターに戻します。線維芽細胞のpheに上皮細胞を添加し、異種細胞共培養を作成します。まず、細胞数を算出した後、前述の手順に従いトリプシンを用いて卵巣上皮細胞の懸濁液を調製します。

上皮細胞増殖培地からの増殖因子の持ち込みを防ぐため、INOF GM培地で1回洗浄します。線維芽細胞OID培養の培地を補充した後、線維芽細胞と上皮細胞の比率が4:1になるように上皮細胞を添加します。INOF GMにおける異所性OIDは、その後14日間、2～3日ごとに典型的な培養方法で培地を更新します。

免疫組織化学染色では、PHEを中性緩衝ホルマリンで固定し、PHEを遠心してペレット化させた後、ホルマリンを70% ethanolに置換します。その後、ヒト組織に用いられる標準的なプロトコルに従ってパラフィン包埋処理を行います。パラフィン包埋されたステロイドは、切片を作成し、H&E染色または免疫組織化学染色による特異的分子マーカーを用いた染色が可能です。

あるいは、ステロイドをPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定します。その後、サンプルをOCTコンパウンドに埋め込み、急速冷凍してクライオスタットで切片を作成し、免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリーで分析します。ステロイドをPBSで洗浄し、37 °CでトリプシンまたはAccutaneを用いて消化し、細胞を分散させます。

1 mLのピペットチップを用いて溶液をピぺッティングすることで、ステロイドの完全な解離による単一細胞懸濁液の調製を促進させることができます。細胞を過剰に刺激しないよう注意してください。等量の培地を加えて反応を中和し、40～70 µmのセルストレーナーに懸濁液を通すことで細胞塊を除去します。その後、細胞をペレット化してPBSで洗浄し、細胞数を計測します。目的の細胞数をFACTSバッファーで再懸濁し、製造元の指示に従って染色を行います。当研究室では、部分的に形質転換させた卵巣上皮細胞と、正常および老化卵巣線維芽細胞を共培養し、卵巣がんの初期段階の発達を模倣させています。

閉経前女性の卵巣において、h hert不死化正常卵巣線維芽細胞の免疫蛍光染色を行ったところ、一次正常卵巣線維芽細胞と不死化正常卵巣線維芽細胞の両方で線維芽細胞特異的タンパク質が発現し、サイトケラチン7は発現せず、ベンチン（menton）が発現していることが示されました。3D形式のPHEで単独培養した正常卵巣線維芽細胞は、紡錘形の形態と豊富な細胞外マトリックスを示します。本研究では、正常卵巣線維芽細胞に過酸化水素を曝露して7日間にわたり老化を誘導し、その後、部分的に形質転換した卵巣上皮細胞と共に14日間培養しました。

これら2種類の細胞を区別するため、得られたスフェロイドに対して、増殖マーカーとしてKi67を、上皮マーカーとしてパンサイトケラチンを用いて免疫染色を行いました。データの定量化により、老化微小環境は部分的に形質転換した上皮細胞の腫瘍的特性を促進する一方で、正常な微小環境は腫瘍の進行を抑制することが示唆されました。また、細胞を単層培養したときには検出できない正常細胞および悪性細胞の組織学的特徴が、3D培養では回復します。例えば、細胞をスフェロイド培養に移行させると、明細胞型卵巣癌細胞株の3D培養では明細胞型卵巣癌の組織学的特徴が検出されますが、同一細胞の単層培養では検出されません。

このビデオを視聴することで、上皮細胞と間質細胞の相互作用を腫瘍発生の初期段階において研究するための、三次元的な典型的培養系の構築方法について十分に理解することができます。3D培養を構築する際は、処理中の材料損失を考慮し、後続のアプリケーションに応じて細胞数を調整することが重要です。

この手順を習得すれば、3D培養を1時間でセットアップすることが可能です。フローサイトメトリーと遺伝子発現マイクロアレイプロファイリングを組み合わせた手法などを併用することで、単層培養条件下では検出されず、3D典型的培養で発生する全般的な遺伝子発現の変化を解析できます。これにより、3Dコア培養の微小環境下で特異的に発生する双方向のシグナリング経路を詳細に解析することが可能になります。