腫瘍の4DライブセルイメージングのためのMAMEモデル：微小環境の相互作用に影響を与える悪性進行

この手順の全体的な目的は、乳腺構造および微小環境エンジニアリング（MAM）と呼ばれる3D共培養モデルを構築し、細胞間相互作用をリアルタイムでライブセルイメージングに利用することです。これは、まずカバーガラスをフィブロネクチン消光（DQ）コラーゲンIマトリックスでコーティングすることによって達成されます。

次に、DQクエンチドコラーゲンI（DQ collagen one）を準備します。凝固したDQコラーゲンIの上に、線維芽細胞を埋入したコラーゲンIマトリックスとともに、再構成基底膜マトリックスを加えます。第3ステップでは、上皮細胞または腫瘍細胞の懸濁液をカバースリップの上に層状に重畳し、細胞をDQコラーゲンIおよび再構成基底膜マトリックスに接着させた後、培地を加えます。

最後に、共焦点顕微鏡を用いて4Dイメージングを行い、生きた乳がん共培養系の3次元的な空間次元に時間軸を加えた解析を行います。最終的に、4Dイメージングによって、浸潤表現型への進行に影響を及ぼし得る乳がん細胞と腫瘍微環境の他の細胞との間の動的な相互作用を可視化および解析することが可能になります。生体内イメージングなどの既存の手法と比較した本手法の大きな利点は、観察される相互作用が、例えばヒト腫瘍細胞とマウス基質細胞の間ではなく、ヒト腫瘍細胞とヒト腫瘍随伴細胞という同一種内の細胞間で生じている点にあります。

一般的に、この手法に慣れていない方は、メインのコア培養物の組み立てをまず視覚的に理解する必要があり、さらに成功させるには相応の技術と練習が必要となるため、苦労することがあります。まず、アルコール滅菌した長方形のプラスチックカバーを1枚用意します。それを35 millimeterの培養皿に入れるか、IBI tree社製の35 millimeter μ-dishを使用してください。

次に、所定数の線維芽細胞をDQコラーゲンと混合します。続いて、100 µLマイクロピペットを用いて、線維芽細胞を含むDQコラーゲン（1コラーゲン：1マトリックス）70 µLをカバースリップの全表面に注意深く分注して広げ、培養皿を二酸化炭素を含まない37 °Cの加湿インキュベーターに30分間置きます。マトリックスが凝固した後、5%二酸化炭素を含む37 °Cのインキュベーター内で10分間平衡化させます。

その後、室温に戻るまでディッシュをフード内に置きます。凝固したDQコラーゲンの上に、60 µLのDQコラーゲンIV再構成基底膜マトリックスと、線維芽細胞を埋め込んだコラーゲンIマトリックスを加えます。次に、ピペットチップを使用して、線維芽細胞を含むDQコラーゲンIコラーゲンIマトリックスを傷つけないように注意しながら、DQコラーゲンIV再構成基底膜マトリックスを均一に広げます。

その後、ディッシュとカバーガラスを5% 二酸化炭素を含む37 °Cのインキュベーターに10分間入れ、DQ collagen IV再構成基底膜マトリックスを凝固させます。その間に、トリプシンを用いて細胞を剥離させ、共培養用の細胞数をカウントします。次に、50 µLの細胞懸濁液をコーティング済みのカバーガラス上に滴下し、細胞がDQ collagen IV再構成基底膜マトリックスに接着するように、5% 二酸化炭素を含む37 °Cのインキュベーターに40〜60分間置きます。細胞がマトリックスに接着した後、2%再構成基底膜を含む培養液2 mLを35 mmディッシュに加えます。

次に、PBSで洗浄した後、MEGM培地に含まれる5 µMのCellTracker Orangeを用いて、37 °C、5% CO2インキュベーター内で45分間共培養物をインキュベートし、目的の期間まで保持してイメージングを行います。インキュベーション後、共培養物を再度PBSで洗浄し、あらかじめ温めておいたMEGM培地を用いて、37 °C、5% CO2インキュベーター内で30分間インキュベートします。共培養物を低倍率でライブイメージングします。例えば、共焦点顕微鏡の水浸レンズを用いて10倍で、構造全体の深さにわたって10 µm間隔で光学切片を撮影します。

Velocityソフトウェアまたは同様のプログラムを使用して、光学切片から画像を3Dで再構築します。構造、細胞間相互作用、および周囲のマトリックスとの相互作用を可視化できるよう、3D再構築の動画を作成してください。この共培養の代表的な概略図では、IBI処理したμ-dishにまずコラーゲンをコーティングし、一方はDQコラーゲンを含み、もう一方はここにマゼンタ色で示すように線維芽細胞を含んでいます。

次に、DQ collagen fourを含む再構成基底膜の2層目を添加しました。続いて、赤色で示された腫瘍細胞を、2%の再構成基底膜の上に播種し、培養しました。

クリーム色の点で示される培地は、培地交換のたびに重ねられました。DQ collagen oneおよびfourの蛍光切断産物は緑色で示されています。この代表的なMCF 10 DCISおよびWS 12 TI共培養の23日間にわたり、ここおよび以降の図で赤色で示される細胞の増殖と、ここおよび以降の図で緑色で示されるDQ collagen fourおよびoneの分解が観察されました。また、共培養の体積減少により、コラーゲンマトリックスの分解が示されました。

同一の生細胞共培養系を23日間にわたり観察し、共培養の3日目、16日目、および23日目に共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影しました。MAM共培養における相互作用は動的であり、時間の経過とともに変化します。例えば、共培養3日目の細胞MAMのこの3Dモデルに見られるように、この時点では細胞がマトリックス内で増殖し始めたばかりであり、緑色蛍光が見られないことから、依然として非常に安定していることが分かります。

しかし、16日目までには、細胞が増殖し続けるにつれて、ここに見られるDQ collagenの1番および4番の切断産物（緑色）で観察されるように、マトリックス構造の分解が始まっています。また、マトリックスと細胞が共蛍光して黄色に見える箇所は、細胞によるマトリックスの能動的な分解を示しています。23日目までには、共培養時の体積が110,000 µm³であった3日目と比較して、急速に増殖する細胞によってマトリックスのほぼ半分が分解されました。16日から23日にかけて、体積はこの日でわずか46,250 µm³まで減少しました。

16の共培養において、赤色で示されたDCIS細胞の表面におけるDQ collagen fourのタンパク質分解と、白色で示された線維芽細胞近傍の領域におけるDQ collagen oneの拡散的なタンパク質分解が観察できます。この共培養で用いられている差別染色により、発達後の2種類の細胞の明確な遊走および増殖パターンの観察も可能です。この手法は、乳がん分野の研究者が、がん細胞と周囲の間質細胞との動的な相互作用をライブセルイメージングで捉え、腫瘍のマクロ環境ががんの進行に及ぼす影響を探索する道を切り開きました。