骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

このビデオで実演する実験の全体的な目的は、抗菌ペプチドlysinが、マウスにおけるデキストラン硫酸誘発結腸炎の改善に役割を果たすかどうかを評価することです。これは、野生型マウスからの骨髄を放射線照射したlysin欠損マウスおよびノックアウトマウスに注入し、またノックアウトマウスからの骨髄を放射線照射した野生型マウスに注入することによって行われます。移植された骨髄により、レシピエント内でドナーの遺伝子型を持つ新しい血球が生成されます。

その後、レシピエントマウスにデキストラン硫酸を投与し、4週間後に大腸炎を誘導します。移植の成功はフローサイトメトリーによって検証し、結腸組織の損傷は組織学的解析により評価します。その結果、ノックアウトマウスに野生型骨髄を移植すると大腸炎が改善することが示されました。

逆に、ノックアウト骨髄を野生型マウスに移植すると、大腸炎は悪化します。この手法は、炎症または感染における骨髄由来細胞または非骨髄由来細胞からの遺伝子発現を特定するための重要な疑問を解決するのに役立ちます。野生型マウスとノックアウトマウスの追跡を可能にするため、本実験ではC57BL/6野生型マウスおよびC57BL/6ノックアウトマウスの使用を推奨します。

骨髄移植後のドナー細胞。野生型マウスとしてCD 45.1マウスを、ノックアウトマウスとしてCD 45.2マウスを使用します。ここに示すチャートは実験設定を表しており、各グループに5匹のドナーマウスと10匹のレシピエントマウスが割り当てられています。

グループAおよびBでは、野生型マウスからノックアウトマウスへ骨髄を移植します。グループAには大腸炎を誘発させますが、グループBには誘発させません。グループCおよびDでは、ノックアウトマウスから野生型マウスへ骨髄を移植し、グループCにのみ大腸炎を誘発させます。グループEおよびFでは、野生型から野生型への移植を行い、グループGおよびHでは、ノックアウトからノックアウトへの移植を行います。放射線照射マウスへの移植に用いるドナー骨髄を調製するため、まずバイオセーフティキャビネット内で、犠牲にしたマウスの骨から骨髄を抽出します。

滅菌済みの解剖器具を用いて、上腕骨、大腿骨、脛骨、および腓骨を、付着している筋肉や靭帯から切り離して露出させ、シャーレに移します。骨の両端を切断し、赤色骨髄を露出させます。次に、ピンセットで骨のいずれか1本を保持します。

3 mLシリンジと25G針を用い、冷PBSで赤色骨髄を別のペトリ皿へ洗い出します。次に、骨の反対側からも同様に洗い出し、さらに多くの骨髄細胞を回収します。この工程をすべての骨に対して繰り返します。

野生型マウスとノックアウトマウスの骨髄をそれぞれ別にプールします。18ゲージの1/2インチ針を装着した6 mLシリンジを用い、吸引と排出を繰り返すことで赤色骨髄プラグを破砕します。その後、セロロジカルピペットを使用して、回収した骨髄を50 mLコニカルチューブに移します。

すべての骨髄を移し終えたら、4°Cで740 Gにて5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、5〜10秒間ボルテックスしてペレットを再懸濁させます。ペレットに、ドナーマウス1匹あたり5 mLのXRBC溶血バッファーを加え、再度5秒間ボルテックスし、室温で正確に3分間インキュベートします。

3分後、各チューブに冷えたPBSを20 milliliters加え、転倒混和して溶解を停止させます。次に、内容物を40 micronのセルストレーナーを通して、新しい50 milliliterコニカルチューブに注ぎます。元のチューブを5 millilitersのPBSで洗浄し、その溶液をセルストレーナーに移します。

引き続き、コニカルチューブにフロースルーを回収します。その後、PBSを加えて液量を50 millilitersにし、転倒混和します。次に、ヘモサイトメーターを用いたトリパンブルー排除法により、生存細胞数を測定します。

細胞数を算出した後、骨髄細胞を4 °Cで913 ×g、5分間遠心分離します。遠心後、全細胞数に基づいて上清を除去します。ペレットをPBSで再懸濁し、1 × 10⁸ cells/mLに調整します。

骨髄細胞を、放射線照射済みのレシピエントマウスに移植する準備が整いました。本実験に使用する野生型およびノックアウトレシピエントマウスには、付属文書の記載通り1000 radの放射線照射を行っています。マウスは病原体フリー施設で飼育・管理されており、照射から4〜24時間後、ドナー骨髄を注入するために、ウォーミングランプの下でヒートパッドを用いてレシピエントマウスを保温します。レシピエントマウスを拘束具に入れ、尾部を70% ethanolで拭いて注入部位を滅菌し、注入を容易にするために局所的な血管拡張を促します。

28.5ゲージの針が付いたインスリン用注射器を用い、1×10⁷個の細胞を1～200 µLの液量で、各マウスの尾静脈に注射します。注射後最初の4週間は、注射済みのマウスを最大3匹まで同じケージに入れて飼育してください。注射後のレシピエントマウスは、抗生物質スルファトリメトプリムを含む水を用意し、オートクレーブ滅菌済みのケージで飼育します。

これにより、動物が免疫力を回復させる時間を設けます。衛生状態を維持するため、4日ごとにケージの交換、および抗生物質を含む水と飼料の交換を行います。放射線照射および骨髄移植の4週間後、抗生物質を含まない通常の水に切り替え、腸内細菌叢を正常に戻すため、さらに2週間マウスを飼育します。骨髄注入の6週間後、大腸炎を誘発するための初期体重を測定します。

大腸炎実験群のマウスに、5%デキストラン硫酸を含む飲水を与えます。5日後、4匹のマウスから末梢血を採取してヘパリンコート済みバキュテナーチューブにまとめ、氷上に置きます。次に、1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、血液 300 µLと細胞染色バッファー 300 µLを混合します。その後、1から5まで番号を付けた5本のフローサイトメトリー用試験管に、氷上で血液を 100 µLずつ分注します。

マウスを安楽死させた後、再度体重を測定し、その変化量を算出します。結腸組織を摘出し、H&E染色用にホルマリンに固定します。その後、前述の方法で骨髄細胞を採取します。

再懸濁した骨髄を、1から5までラベル付けした5本のマイクロ遠心チューブに、それぞれ100 millilitersずつ分注します。フローサイトメトリー解析の準備として、添付文書の記載に従い、各チューブ用の抗体混合液を暗所で調製します。番号1とラベル付けした血液および骨髄サンプルはコントロールとして使用し、染色は行いません。番号2とラベル付けした血液および骨髄サンプルは、fitzy isotype control、PE isotype control、およびCD 16/32ブロッキング溶液で染色します。

これらのアイソタイプコントロールは、一次抗体のサンプル結合の特異性を確認するために使用されます。番号3のラベルが付いたサンプルは、FZ CD 45.1およびCD 16/32で染色されます。ブロッキング溶液である番号4のラベルが付いたサンプルは、CD 45.2およびCD 16/32で染色されます。

ブロッキング溶液。単色標識により、血液または骨髄中のドナー細胞またはレシピエント細胞の存在を明らかにすることができます。サンプル5番の標識は、CD 45.1、CD 45.2、およびCD 16/32で染色されます。

ここでの二色標識により、血液または骨髄におけるドナー細胞とレシピエント細胞の相対比率が示されます。抗体混合液2および5を、それぞれのサンプルチューブに5 µLずつ加えます。次に、抗体混合液3および4を、それぞれのサンプルチューブに3 µLずつ加えます。

すべてのチューブを氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各チューブにXRBC lysis bufferを2 mL加えます。その後、サンプルを遮光した状態で氷上でさらに15分間インキュベートします。

細胞を350 ×gで4 °C、5分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、ペレットを500 µLの細胞染色バッファーを用いて暗所で再懸濁します。その後、短時間ボルテックスします。

次に、免疫染色した血液および骨髄サンプルのフローサイトメトリーを行います。野生型CD 45.1をFZで、ノックアウトCD 45.2をPEで表すように選択してください。フローサイトメトリーの結果は、Flo Joeソフトウェアを用いて解析します。

血液および骨髄においてドナー遺伝子型が優性遺伝子型であるかを確認するため、fit E対PE比、またはPE対fit e比を算出します。この画像は、正常な組織像およびDSS大腸炎を呈する結腸のH&E染色像の例を示しています。組織像のスコアリングは、粘膜組織の損傷および粘膜・粘膜下組織への好中球浸潤に基づいて行われます。

したがって、組織学的スコアが高いほど大腸炎が重度であることを示し、lyinが大腸炎の予防に役割を果たしているかどうかを検証します。本ビデオで説明した通り、野生型マウスとノックアウトマウスの間で骨髄移植を行いました。その後、組織学的評価を行い、ここに示す通りにスコア化しました。

ノックアウトマウスの骨髄を照射した野生型マウスに導入したところ、組織学的スコアが有意に上昇しました。逆に、野生型マウスの骨髄をノックアウトマウスに導入すると、スコアが有意に低下しました。これらのデータは、骨髄由来細胞からの内因性Cが抗炎症作用を持ち、大腸炎を改善することを示しており、これらのマウスにおいて移植が成功したことを裏付けています。

移植後、マウスの骨髄および血液を用いてフローサイトメトリーも実施した。ここに示すように、野生型の骨髄はFitz CD 45.1に強く染色されるが、PE CD 45.2には染色されない。一方、ノックアウト骨髄はPEに強く染色されるが、Fitzには染色されない。しかし、移植後、ノックアウト骨髄を移植された野生型マウスの骨髄および血液は、ともにFitzではなくPEに強く染色された。これは、染色された細胞の主要な集団がドナー由来であることを示している。

同様に、野生型の骨髄を移植したノックアウトマウスの骨髄および血液では、fitzyは強く染色されましたが、peは染色されませんでした。これにより、染色された主要な細胞集団がドナー由来であることが改めて確認されました。このビデオを視聴することで、骨髄移植実験を実施し、骨髄由来細胞を介して大腸炎を修飾させることができるようになります。