機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

この手順の全体的な目標は、下流の機能研究と養子移植実験のために、マウスの骨髄から好中球を分離して標識することです。これは、最初にマウス、大腿骨、脛骨から骨髄細胞を採取することによって達成されます。第2ステップでは、赤血球をそれぞれ0.2%および1.6%の塩化ナトリウム溶液に順次懸濁することにより、赤血球を浸透圧的に混合します。

次に、好中球を密度勾配遠心分離法により単離します。最終ステップでは、好中球をセルトラッカー色素で標識します。最終的には、フローサイトメトリーを使用して、さまざまなマウス組織にリクルートされた養子縁組された好中球の数を決定できます。

マウス好中球を骨髄から血液または腹膜上に単離する主な利点は、下流の機能研究および養子移植実験に十分な多数の細胞を、定常状態および感染後の両方で骨髄から得ることができることである。蛍光活性化細胞ソーティングの免疫磁気選択よりもマウス好中球を単離するために勾配遠心分離技術を使用する利点は、迅速で経済的であり、好中球の活性化を誘導する可能性のある抗体で好中球を標識することを避けることです。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるmuca swami usです 安楽死させたマウスに70%エタノールをスプレーした後。

動物の皮膚の中腹部を切開し、次に動物の遠位部分(下肢を含む)から皮膚組織を切除します。次に、ハサミを使って動物の後肢から筋肉を切り取り、次に大腿骨の頭を壊さないように、股関節からACEベウムを慎重に脱臼させます。次に、メスのはさみを使用して、大腿骨と脛骨から残りの筋肉を取り除きます。

膝関節で脚の骨を分離し、骨の端を壊さないように注意し、氷冷したRPMI 1 6 4 ohの入ったシャーレに骨を入れます。FBSと抗生物質を補給します。皿を組織培養フードに移し、次に新しいペトリ皿で各骨の外側を70%エタノールで滅菌します。

約10〜15秒後、氷冷した滅菌PBSで3回の洗浄を行い、各骨の表面からエタノールをすすぎます。次に、各骨から骨端を切り取り、新しい滅菌ペトリ皿に入れます。次に、10ミリリットルのRPMIを充填した12ccの注射器に25ゲージの針を取り付けます。

FBSとEDTAで補足します。次に、各大腿骨脛骨ペアのシャフトの両端から骨髄細胞を、100マイクロメートルのフィルターで色あせた50ミリリットルのスクリュートップファルコンチューブに洗い流し、すべての細胞を除去します。針先で骨の内面をこすります。

骨が白くなっているように見える場合、細胞は十分に除去されています。次に、メスを使用して骨端を0.5〜1ミリメートルの小さなQピースに切断し、次に2.5ミリリットルのエイノアコームチップとBioPureピペットチップの後端を使用して、100マイクロメートルのフィルターに骨を粉砕します。採取した細胞をGの427倍、摂氏4度で7分間スピンダウンした後、赤血球を0.2%塩化ナトリウムの20ミリリットルで約20秒間スピンダウンします。

次に、20ミリリットルの1.6%塩化ナトリウムで溶解を停止し、細胞をスピンダウンしてから、FBSおよびEDTAを含むRPMI 1 6 4 OHサプリメントにペレットを再懸濁します。細胞を数え、再度スピンダウンした後、洗浄したペレットを氷1ミリリットルあたり6個の細胞に100倍以下の値で再懸濁します。冷間滅菌PBS今18〜26°Cの3ミリリットルを分配し、彼の不透明な1 1 1 9を15ミリリットルの円錐管に、その後、18〜26°Cの3ミリリットルをゆっくりと重ねます。

彼の不透明な1 0 7 7。彼の不透明な1 0 7 7遠心分離機の上に骨髄細胞懸濁液を慎重に重ね、834倍Gで30分間密度勾配をGと摂氏25度で中断せずに、彼の不透明な1 1 1 9と1 0 7 7の層の界面で好中球を収集します。RPMI 1、6、4、OH、FBSおよび抗生物質Resusで収集した好中球を2回洗浄した後、細胞をPBSで1ミリリットルあたり5倍10〜6細胞で懸濁し、摂氏37度に予熱します。

細胞をカウントした後、各実験サンプルの少量のアリコートを予約して、フローサイトメトリーによる純度と生存率を決定し、残りの好中球を最終濃度5マイクロモルのセルトラッカー色素で10分間、暗闇の中で振とうする水浴中で摂氏37度で標識します。最後に、氷冷したRPMI 1 6 4 OHサプリメントとFBSおよび抗生物質を含むサプリメントで細胞を2回洗浄し、色素の相互汚染を回避してから、下流の競合再増殖研究のために差次的に標識された好中球集団を混合する前に、骨髄単離密度勾配の代表的なフローサイトメトリープロットを非感染のC 57ブラックシックスマウスから分離したこのパネルに示します。histopath 1 1 1 9 と histopath 1 0 7 7 の界面から採取された骨髄細胞に用いられた初期ゲーティング。

前方散乱光と側方散乱光を使用すると、密度勾配で分離された好中球は、養子移植細胞トラッカー後少なくとも4時間、純度が90%を超え、生存率が95%を超えることが実証されています。DIA標識好中球は、さまざまなマウスの問題でフローサイトメトリーによって追跡できます。例えば、この実験で示されたC57黒色6匹マウスに感染したレシピエントの骨髄および腎臓の血液において、生CD45LY6GのCD11B細胞にゲーティングすることにより、これらの代表的な養子転用C-M-T-M-R標識好中球は、それらのPE発現によりレシピエントマウスの天然C-M-T-M-RおよびPE陰性好中球と区別することができる。

一度習得すれば、マウス骨髄好中球の単離と標識は3時間で完了することができます。