インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

本実験の全般的な目的は、ここでは単一の遺伝子または遺伝子配列から開始し、X線結晶構造解析によって標的タンパク質の構造を決定するためのマルチターゲットアプローチを用いることです。標的タンパク質は、ウイルス複製における重要な構成要素であるインフルエンザA型由来のPB2ポリメラーゼサブユニットです。このマルチターゲットアプローチは、まず単一の標的配列およびタンパク質について既知のその他の情報に基づき、一連の遺伝子構築物を並行して設計およびクローニングすることで実現されます。

第2段階では、各構築物の発現レベルをテストし、細胞培養による大規模なタンパク質発現に最適なものを選択します。次の段階では、細胞を破砕して発現材料から標的タンパク質を回収し、それぞれを極めて高い純度まで精製する必要があります。その後、各タンパク質を用いて一連の結晶化試行を行い、X線研究に適した結晶形態を得ます。

その後、1つまたは複数の結晶から高解像度のX線回折データを収集し、それを用いて各標的タンパク質の構造を示す電子密度マップの解析および精密化を行います。これらの結果に基づき、電子密度マップから標的タンパク質の三次元構造を構築することが可能になります。マルチターゲット処理を行うことで、プロセスのあらゆる潜在的な障害に対して実行可能な代替案が得られるため、構造決定の成功率を大幅に高めることができます。

複数の標的を並行して扱うことは非常に効率的であり、各ステップにおける1タンパク質あたりの時間とコストを削減できます。創薬標的の構造決定速度を向上させる可能性により、年間での治療法開発の機会を増やすことができます。この手法は構造生物学において貴重な知見を提供できるだけでなく、これらの手法で得られる高品質なタンパク質は、あらゆるタンパク質ベースの研究を支援することが可能です。

プロセスの各段階には独自の科学的根拠があり、それぞれに専門知識が必要となりますが、人材、機器、およびノウハウへの投資は、すべての要素が組み合わさったときに大きな成果をもたらします。調査対象となる標的遺伝子と遺伝子産物が選定された後、最初のステップとして、複数の遺伝子変異体または構築物の設計が必要となります。これらの構築物は、タンパク質レベルでの設計と、それに伴う設計合成遺伝子配列のコードを用いて、Gene Composerソフトウェアを使用して設計されます。

アライメントビューワーモジュールとコンストラクト設計モジュールを使用して、タンパク質配列のアライメントを比較し、タンパク質コンストラクト設計のためのインサートPCRおよびベクターPCRの末端プライマーまたはアンパーを定義します。次に、ジーンコンポーザーのタンパク質-DNAアルゴリズムを使用して、各アミノ酸配列を設計された核酸配列のコドンに逆翻訳します。適切なコドン使用量表を用いて、特定の細胞株での発現に向けて配列を最適化してください。

本ケースでは、大腸菌（E. coli）を使用します。目的遺伝子の配列が決定したら、仮想的にクローニングを行い、細菌発現に適したベクタープラスミドに遺伝子を挿入します。ここでは、改変したpET 28ベクターを使用します。

このベクターには、発現およびタンパク質精製に必要な特定のコンポーネントが含まれています。標的遺伝子は、タンパク質のN末端またはC末端にヒスチジンタグ配列を組み込み、精製中にタグを除去するための切断配列を組み込むように修飾されています。また、このベクターは、発現試験および培養用の抗生物質耐性遺伝子を有しています。

次に、PIPEクローニング（Polymerase Incomplete Primary Extension cloning）の準備として、標準的な遺伝子合成法により各標的タンパク質の遺伝子配列を作成します。PIPEクローニングとは、目的のベクターに相補的なプライマーを用いて標的遺伝子を増幅させるPCRベースのクローニング戦略です。この手法は、PCRの後期段階における不完全な性質を利用しており、これによりPCR産物の末端に可変的な一本鎖領域が残ります。各反応系にフォワードプライマーとリバースプライマーを5 µLずつ添加し、インサートPCR（IPCR）を調製します。

プレートマップに従い、96ウェルプレートの適切なウェルに、各フルレングスの合成遺伝子を2 µLずつ分注します。各ウェルに25 µLのPFUマスターミックスを加えた後、以下のPCR条件で25サイクル反応させます。95 °Cで30秒間変性させます。

50 °Cで45秒間アニールさせ、その後68 °Cで3分間伸長させます。断片の増幅は、IPCR産物のAGROSゲル解析によって確認します。IPCRが成功した産物は、明瞭なバンドとして示されます。

望ましくない結果は、多くの場合、別の反応における薄いバンドやスメア状のバンドとして観察されます。発現プラスミドをベクターPCRで増幅するか、またはVPCR産物のAROSゲル解析によってVPCR断片の増幅を確認します。IPCRおよびVPCRの産物が増幅された後、それらをマージプレートに添加し、マージ反応のためにサーモサイクラーにセットします。

構築に成功したクローニングコンストラクトを化学的コンピテントE. coli細胞に形質転換し、発現試験のストリークを開始するためにグリセロールストックとして保存します。各サンプルの少量をグリセロールストックから個別の寒天プレートにストリークします。プレートは細菌用栄養ブイヨンで調製し、ベクターにコードされた抗生物質マーカーとしてKanamycinを添加し、37 °Cで一晩インキュベートします。

新鮮に培養されたアガープレートから単一のコロニーをピックアップし、各サンプルの前培養を開始します。このコロニーを用いて、パラレル処理用にカナマイシンとグルコースを添加した1.2 millilitersのTBブロスに接種します。各前培養は96ウェルラウンドボトムブロックで行います。

37 °Cで220 rpmで振盪しながら一晩培養します。一晩の培養後、前培養液を40 µL用いて、各サンプルの小スケール誘導培養を開始します。

1.2 mLのTBブロス。50 mg/mLのカナマイシンおよびNovaGen Overnight Express Systemを添加。1. 誘導培養液を20 °Cで48時間、220 RPMで振盪しながら培養し、4,000 ×gで15分間遠心分離して細胞を回収する。

上清を捨て、精製後のさらなる処理に備え、ペレットを−20°Cで少なくとも1時間保存する。メーカーのプロトコルに従い、Caliper Lab CHIP 90システムを用いたキャピラリー電気泳動により、切断反応ありとなしの両条件でタンパク質を分析する。インフルエンザA型PB2タンパク質の場合、34種類の構築物のうち14種類で可溶性標的タンパク質が得られ、次ステップの大規模発酵へと進んだ。

大規模培養を開始するために、グリセロールストックから50 mg/mLのカナマイシンを含む細菌細胞培養液100 mLに接種し、37 °Cで一晩振盪培養します。振盪速度は220 RPMに設定してください。翌日、この前培養液10 mLを用いて接種し、培養規模を拡大させます。

2Lのバッフルフラスコに、オートインダクション培地と50 mg/mLのカナマイシンを含むブロス1Lを分注します。拡大培養した細胞を37 °Cで約30分間隔で振盪します。600 nmの波長におけるUV吸光度を測定し、培養液の光学密度を確認します。

光学密度が0.6に達した後、所定の培養時間を経過したところで、振盪インキュベーターの温度を20 °Cに変更します。発現試験のため、各コンストラクトから代表的な10 mLのアリコートを分取します。5,000 ×gで15分間遠心分離し、細胞を回収します。

上清を捨て、細胞ペレットを-80°Cで凍結します。本手順を開始するには、細胞ペーストを溶解バッファーで1:5のマスターボリューム比で解凍し、再懸濁します。4°Cで30分間、激しく撹拌します。

清潔なスパチュラを使用して、ビーカーの側面から塊をかき出します。氷上で超音波破砕機を用いて細胞を機械的に溶解します。粗溶解液を4°Cで30分間、18,000 GForceで遠心分離し、清澄化します。

上清を回収し、大規模精製に進む前に分析用の少量の分注液を保存します。SDS-PAGEゲル分析により、各培養液の大規模タンパク質発現を確認します。この代表的なSDS-PAGEの結果は、強固なタンパク質発現、およそ50%の溶解度、および約50%の切断を示しています。

本ケースでは、元のコンストラクトで設計されていたタンパク質溶解性タグとともに、ヒスチジンタグが除去されました。ニッケルレジンを用いて、固有のヒスチジンタグを持つ標的タンパク質を、天然の細菌タンパク質を含む他のすべての細胞物質から分離します。ニッケルカラム1本を準備し、まず4カラム分量の超純水で洗浄して保存バッファーを除去し、続いて1カラム分量のバッファーBと5カラム分量のバッファーで洗浄します。

AおよびEの平衡化の並列処理は、複数のカラムを同時に走行させることが可能なプロテインメーカーを用いて行います。可溶化されたヒスチジンタグ付きタンパク質を含む各清澄化ライセートを、2 mL/minの流速で個別のカラムにロードし、続いてバッファーAで数カラム分洗浄し、フロースルーバッファーを回収して分析用に保存します。結合したタンパク質を、バッファーAとBを用いた一連のステップグラジエント（95:5、60:40、最終的に100%バッファーB）で溶出させます。バッファーBの成分がニッケル樹脂に対してヒスチジンと競合するため、規定の比率でタンパク質がカラムから除去されます。

各溶出画分を個別に回収します。ここでは、ニッケルカラムを用いて行ったランの代表的なクロマトグラムの結果を示します。ニッケルカラムで溶出された画分、粗溶解物、清澄化溶解物、およびニッケルカラムのフロースルーをSDS-PAGEで解析し、カラム精製中に測定された280 nanometersにおけるUV吸収度と比較してください。

このステップでは、精製が成功したかどうかを判断します。目的タンパク質を含むフラクションを選択してプールし、以降の処理へと進めます。プールしたフラクションの全量と、280 nmにおけるUV吸光度を測定し、タンパク質の理論的な消光係数を用いて、この段階でのタンパク質の総量を算出します。

分析用に少量のサンプルを保存します。目的タンパク質の遺伝子には、ULP1が切断部位として認識する特定の配列がコードされており、ULP1を添加することでヒスチジンタグと目的タンパク質の間が切断されます。この手順を開始するには、回収した分画に含まれるタンパク質5 mgあたり1 µLのubiquitin like protease, oneを添加します。

この時点で、切断されたタンパク質を透析チューブを用いてバッファーBからバッファーAに移行させ、攪拌しながら4°Cで4時間、2LのバッファーAに対して透析を行います。PB2については、透析後に10kDaの分画分子量（MWCO）のものを使用してください。ULP1存在下および非存在下で、標的タンパク質のSDS-PAGEを再度実施します。

これにより、ULP1による切断が成功したかを確認し、今後の処理に用いる最適なフラクションを選択することができます。ここでは、ポリメラーゼpbの3つの構築物における代表的なSDS-PAGEの結果を示します。1レーン目には2種類のサブユニット分子量マーカーが含まれています。

レーン2、6、および10は、ニッケル1カラムからのプール済みタンパク質です。レーン3、7、および11は、ニッケル2からのバッファーA中の切断タンパク質のフロースルーを含み、レーン4、8、および12は、ニッケル2からのバッファーB中でのヒスチジンタグの除去を示しています。

ヒスタミンを除去した後、ニッケルカラムから得られた統合画分を濃縮します。SECを開始するために、標的分子の分子量に基づいて適切なレジンを再度選択する必要があります。本手順では、Superdex 200 Increase 10/300 GLカラムを使用し、5 mLシリンジを用いて0.5 mL/minの流速で200 mLのSECバッファーにより平衡化させます。サンプルを10 mLサンプルループにロードし、SECカラムランを開始します。小容量の画分を回収しながら、280 nmにおけるUV吸収クロマトグラムをモニターします。

すべての関連するSEC分画をSDS-PAGEで解析します。タンパク質結晶化試験の標準的なアプローチは、蒸気拡散法を用いたシッティングドロップ法によって行われます。各標的タンパク質に対して、最初から2つ以上のスパースマトリクススクリーンをセットアップすることは一般的です。

このプロセスを開始するには、96ウェル小型ジュニア結晶化プレートの各リザーバーに、選択した結晶化スクリーンの各条件を80 µLずつあらかじめ分注します。次に、SECバッファーで調製したタンパク質を、96個の各ウェルに0.4 µLずつ分注します。続いて、結晶化スクリーンの溶液を0.4 µL加え、各ウェルのドロップが完全に混合するようにします。プレート全体をクリスタルクリアシーリングテープで覆い、すべてのウェルが完全に密封されていることを確認してください。その後、プレートを環境振動のない静穏な場所で16 °Cに保存します。

今後数週間にわたり、解剖顕微鏡下でタンパク質の結晶化を定期的に確認します。タンパク質結晶が現れない場合は、回収前に成功率を高めるため、条件を変えて新しいプレートをセットし、最終ドロップ内のタンパク質濃度を変化させてください。回収を開始するために、液体窒素を満たしたデュワー瓶の中でALSスタイルのパックを冷却し、蓋で閉じます。

標的タンパク質結晶が入ったウェルを覆っている透明テープを切り、近くの空きウェルへ移動させます。対応する結晶化条件液 1.6 µL を加え、そこにエチレングリコール 0.4 µL を混合します。結晶化条件液にエチレングリコールを 20% 含む溶液を用いることで、タンパク質結晶を保護します。

クライオ凍結の際、顕微鏡下で結晶を分析し、採取に適したクライオループを選択します。このとき、ループの内径を結晶の最大幅に合わせます。クライオループをマグネティッククリスタルワンドに取り付け、ウェル溶液から直接結晶をループで掬い上げます。結晶を採取したクライオループを直ちにクライオ保護剤に浸し、その後、LSスタイルのパックに浸漬させます。

目的の個数の結晶が得られるまで、結晶を急冷（フラッシュフリーズ）します。回収が完了したら、パックワンドを使用して、急冷した結晶が入ったパックにマグネットリッドを装着します。次のステップに進むため、パックを裏返します。

パックプッシャーをパックにねじ込み、パックをKU actor doerに移して蓋を打ち抜きます。パック内の結晶は、J Director画像取得ソフトウェアを用いたX線回折研究に供されるまで、液体窒素浴の中で凍結状態で保持されます。結晶スクリーニング用に、ビームスリット0.5度、検出器距離50mm、イメージステップ70度、露光時間30秒のパラメータを設定します。

結晶のスクリーニング中の画像取得ソフトウェアのスクリーンショットの例を以下に示します。中央のパネルには、代表的な結晶から得られたX線回折像が表示されており、3次元構造決定に必要な完全なデータセットを得るために、高解像度で十分な枚数の画像が収集されています。本ビデオで示したクローニングおよびタンパク質精製戦略により、14個の精製PB2サンプルが得られ、そのうち9個が回折研究に適した結晶を形成しました。施設内のX線回折データセットは、Rigaku Super Bright FRE Plus回転陽極X線発生装置（Ossec Variax HF、HF光学系、およびSaturn 944 Plus CCD検出器を搭載）を用い、QK α線を使用して、9つの構築物のうち5つについて収集されました。

ポリメラーゼPB2サブユニットのX線回折像をここに示します。各データセットを処理し、計4つのPB2サブユニット構造を決定しました。各構造は査読を経て、公開アクセス用にプロテインデータバンクにアップロードされました。

この図は、結晶学的非対称単位における分子のリボン図を示しています。4つのPB2構造について、二次構造は対応するPDBコードと共にレインボーカラーで色分けされています。この表には、本ビデオ記事で述べた手法によるインフルエンザPB2ターゲットの解析結果が示されています。

遺伝子から構造決定に至るマルチターゲット並列処理パイプラインは、クローニング、溶解性確認、精製、結晶化、および構造決定の5つのステップで構成されています。当社の構造生物学パイプラインの成果は、構造ベースの研究の基盤となるだけでなく、タンパク質機能を検証するための機能アッセイや、創薬の新たな出発点を特定するためのMARまたはSPRによる新規化合物の生物物理学的スクリーニングなど、さらなる研究へと展開されます。この手法と併せて開発されたツールは、構造ベースの創薬を含む、発見ベースの多種多様な研究への道を構造生物学者に切り開き、人類の健康と疾患治療に多大な影響を与えてきました。

このビデオを視聴することで、マルチターゲット並列処理がいかに構造決定の成功率を大幅に向上させることができるかを十分に理解していただけるはずです。構造生物学の研究室での作業は非常に危険を伴う場合があるため、実験活動に従事する際は、PPEの使用など適切な予防措置を常に講じることを忘れないでください。