勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

この速度勾配遠心法の全体的な目的は、細胞進入時にウイルスが直面するエンドサイトーシス環境を模倣した条件下で、インフルエンザAウイルスキャプシドを分析することです。この手法は、軽度の酸性pHがキャプシドの安定性に及ぼす特異的な影響など、細胞進入中にインフルエンザAウイルスキャプシドがどのように解体されるかという重要な疑問を解明するのに役立ちます。この技術の主な利点は、定義された実験条件下でインフルエンザAウイルスの脱殻プロセスの定量的な分析が可能になることです。

この手法は、インフルエンザAウイルスの脱殻がどのように開始されるかについての知見を提供すると同時に、関連する脱殻機構を持つ他のエンベロープウイルスの研究にも適用できます。本手順の実演は、私の研究室の元学生であるFirat Neblogluが行います。テキストプロトコルに従ってストックバッファーと試薬を調製した後、テストする各pH条件について、1 Mの塩化ナトリウム 9 mL、10% NP40 6 mL、25Xプロテアーゼ阻害剤ストック 2.4 mL、および二回蒸留水 9 mLを混ぜ合わせて、界面活性剤バッファーマスターミックスを調製します。

次に、各pH条件について、マスターミックス4.4 millilitersを50 milliliterコニカルチューブにピペットで分注します。pHが5.8より高い場合は、それぞれのpH調整済み500 milliMolar Trisストック溶液を0.6 millilitersチューブに加えます。pHが5.8以下の場合は、それぞれのpH調整済み500 milliMolar MESストック溶液を0.6 milliliters加えます。

300 mM 塩化ナトリウム、2X プロテアーゼ阻害剤、60 mM Trisを含み、pH 7.4に調整した二回蒸留水を用いて、バッファー溶液を5 mL調製します。これを界面活性剤を含まないコントロールグラジエントバッファーとして使用します。次に、界面活性剤含有および界面活性剤非含有の各バッファー混合液5 mLに、50%グリセロールストック溶液を5 mLずつ加え、6種類の異なる25%グリセロール溶液を作成します。

pH試験紙を使用してpH値を確認します。50%グリセロールストック溶液と蒸留水を3:7の比率で混合し、15%グリセロール溶液を調製します。5 mLシリンジと針を用い、6本のウルトラクリア遠心チューブに15%グリセロール溶液を3 mLずつ加えます。

各ステップの後に、針を二回蒸留水で洗浄します。5 mLシリンジと長い針を用い、2層が混ざらないように注意しながら、15% glycerol層の下に3.4 mLの25% glycerol溶液を慎重に注入します。両層の間の界面がはっきりと確認できます。

それぞれのpH調整済みグリセロール溶液を用いて、テストする全6条件についてこの操作を繰り返します。次に、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で、インフルエンザAウイルスを含む清澄化・希釈済みの尿膜液1 mLを用いて、グリセロール勾配の上層を慎重に覆います。チューブをローターバケットに移し、対向するチューブの重量バランスを合わせた後、あらかじめ冷却したSW-41超遠心機ローターに注意深くセットします。

2100 rpm、12 °Cで150分間遠心分離します。遠心分離後、清潔なパステールピペットとアスピレーターを用いて、グリセロール層を2層とも慎重に取り除きます。次に、40 mLの1X非還元LDSサンプルバッファーを加え、ピペッティングでペレットを完全に再懸濁させてから、サンプルを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

SDS-PAGEを行うには、すべてのサンプルを95 °Cで10分間加熱します。溶解したペレット20 µLをプリキャストグラジエントBis-Trisミニゲルにロードし、1X MOPS SDSランニングバッファー中で200 Vで1時間泳動します。その後、ゲルを固定液中で1時間インキュベートします。

水で1〜2回洗浄し、15 cmの細胞培養ディッシュ内で十分な量のコロイドCoomassie溶液に浸し、室温で緩やかに振盪しながら一晩染色します。二回蒸留水で脱色し、ゲルの背景が透明になるまで15〜20分ごとに液を交換します。バンドの定量のためにスキャンを行うまで、ゲルを二回蒸留水に入れ4 °Cで保存します。

最後に、ゲルを高解像度でスキャンし、市販のカスタムソフトウェアを用いてタンパク質バンドの強度を定量します。各バンドに近い領域のバックグラウンド信号を差し引き、値を界面活性剤不含のコントロール値で正規化します。本実験では、精製した尿囊液由来のX31をpH 7.4から5.0の範囲で速度勾配遠心分離にかけ、SDS-PAGEで分析しました。

勾配中に界面活性剤が存在しない場合、完全なビリオンがペレット化され、クマシー染色ゲルにおいてHA、NP、およびM1を示す特徴的なバンドパターンとして現れます。底部グリセロール層にNP40を添加すると、HA、NA、およびM2を含むウイルスエンベロープが可溶化され、超遠心分離中にウイルスコアのみがペレットへと沈降しました。pH 6.5以下から、M1はペレット画分から徐々に消失し、pH 5.8からpH 5.4の間で最小値に達します。

pH 5.8以下では、vRNPが解離し、その結果ペレットから消失しました。解析したタンパク質バンドから、M1層の分解とvRNP束の解離に関する2つの明確なpH閾値が明らかになり、それぞれpH 6.5およびpH 5.8でした。この手順を行う際は、インフルエンザAウイルス株や変異株によって、異なる分解特性が観察される可能性があることに留意することが重要です。

本手順に続いて、電子顕微鏡法などの他の手法を用いることで、単離したインフルエンザウイルスキャプシドの構造など、さらなる知見を得ることができます。