ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

本プロトコルでは、ルシフェラーゼレポーター細胞株の作製と、それに続く細胞自律的な生物発光発現の概日リズムのモニタリングについて詳述します。まず、レンチウイルスルシフェラーゼ発現レポーターを構築してレンチウイルス粒子を産生し、目的の細胞に感染させて選択した培養細胞を増幅させます。次に、適切な記録装置を用いて、同期させたレポーター細胞における生物発光発現をモニタリングします。

最終的に、生物発光記録を用いて細胞自律的な概日リズムを実証します。一過性トランスフェクションや生殖細胞系列保護などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、VIRが介在していることです。これにより、細胞ゲノムへの安定した組み込みが可能となり、効率性と汎用性も向上します。

この手法は、概日時計研究の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、組織特異的な概日時計は存在するのか、また、もし存在するならば、組織特異的な概日時計にはどのような特性があるのか、といった点です。

この手法は時計機構に関する洞察を得るだけでなく、細胞周期のダイナミクスや腫瘍形成などの他のシステムにも適用可能です。私たちは、組織または細胞型特異的なエピジェネティッククロックを研究することを決定した際に、初めてこの手法を考案しました。

本手順のデモンストレーションを行うのは、博士研究員であるDr. Chita Norm Napkinと、私のAtory研究室の大学院生であるSandraです。通常、哺乳類の概日リズムリポーター構成体は、概日リズムプロモーターがルシフェラーゼ遺伝子と融合した発現カセットを含んでいます。このレンチウイルスリポーターでは、不安定化ルシフェラーゼがマウスのper2プロモーターの制御下にあります。

組換え反応によるレポーターベクターの構築に関する詳細な手順については、効率的なトランスフェクションに関する付随する原稿を参照してください。まず、コンフルエンスが90〜100%に達した低継代数のヒト胚性腎細胞の培養液を用意します。次に、6ウェル培養プレートをコーティングします。

トランスフェクションのために、各ウェルに0.001% poly L lycineを1 mL加え、室温で20分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄します。次に、トリプシンを用いて細胞を回収し、あらかじめコーティングしたプレートの各ウェルに細胞を播種します。プレートを円を描くように揺らし、細胞を均等に分散させます。

1.5 mLマイクロ遠心チューブ内において、播種した細胞が80〜90%のコンフルエンスに達していることを確認します。トランスフェクションおよびその後の感染の両方のコントロールとして、レンチウイルスリポータープラスミド、DNA、および3つのパッケージングベクターを含むプラスミドトランスフェクションミックスを調製します。さらに、CMVプロモーターの制御下で強化緑色蛍光タンパク質を保持するレンチウイルスGFP発現ベクター用のウェルを1つ追加します。

次に、0.25 M 塩化カルシウムを 100 µL プラスミドに加え、十分に混合します。その後、2x BBS 溶液を 100 µL 加え、穏やかに、かつ十分に混合します。この DNA 混合液を室温で 15 分間インキュベートします。

待機している間に、2 9 3 T細胞の培地を2 mLの新鮮な培地に交換します。プレートをインキュベーターに戻し、培地のpHを平衡化させるため、少なくとも10分間保持します。次に、トランスフェクションミックスを細胞に滴下し、プレートを静かに回しながら顕微鏡下で粒子の形成を確認し、その後、細胞をオーバーナイトでインキュベーターに入れます。

トランスフェクションから約16時間後、2 mLの新鮮なDMEMを補充し、一晩培養します。次に、トランスフェクション効率を評価するため、トランスフェクションコントロール細胞におけるEGFPの発現を確認します。高いEGFP発現を伴う90から100%のトランスフェクション効率は、ウイルス調製が良好であることの信頼できる予測指標となります。

分泌された感染性ウイルス粒子を含む培地を回収し、遠心分離して残存する293T細胞を除去し、ウイルスを含む上清を回収します。3日目に、12ウェルプレートに約12,000個の293T細胞を播種し、コンフルエンシーが20～30%になるまで一晩培養し、4日目に細胞を観察します。同じく4日目に、回収したウイルス粒子含有培地にpolybreneを加え、ピペッティングにより十分に混合します。

次に、3つのT3細胞から培地を吸引し、1ウェルあたり1 mLのウイルス混合液を加えます。37 °Cで一晩インキュベートした後、細胞をPBSで1回洗浄し、培地を補充して、回復と増殖のために37 °Cで一晩インキュベートします。細胞がコンフルエントになったら、細胞を継代し、翌日まで一晩培養します。

感染細胞の選択を開始するには、10 µg/mLを含む新鮮な培地を添加します。Blasticidinによる死滅濃度は、各細胞株ごとに実証的に決定する必要があります。抗生物質耐性細胞を継続的に選択するため、Blasticidinを含む培地を2〜3日ごとに補充してください。

時計リポーターの発現。ブラスチン耐性リポーター細胞の培養液を35 mm培養ディッシュに播種し、コンフルエントになるまで増殖させます。通常、各条件における表現型解析のため、各リポーター細胞株につき3枚以上のディッシュを用意します。PBSで1回洗浄した後、10 µMのフォルリンまたは200 nMのデキサメタゾンを含むDMEMを加え、37 °Cで1時間インキュベートして細胞を同期させます。

次に、細胞を新しく調製した記録用培地に置換します。培養ディッシュを40 mmの滅菌カバーガラスで覆い、蒸発を防ぐために真空グリースで密封します。ディッシュをlumous cycleルミノメーターにセットし、リアルタイム生物発光測定を開始します。

記録：96ウェルプレートを用いた記録について。GSR 2記録装置の詳細については、付属の原稿を参照してください。lum cycle解析プログラムを用いて、5〜7日間のリズムを容易に記録できます。

まず、生データに対してベースライン補正を行います。次に、ベースライン除去後のデータを用いて正弦波へのフィッティングを行い、持続的なリズムを示す試料について必要なパラメータを決定します。高い過渡ルミネッセンスにより、90%以上の良好なフィッティング精度が容易に得られます。

センサーの感度調整と培地交換を行います。通常、データ提示のための解析では、最初のサイクルのデータは除外します。必要に応じて、時間に対する生データをプロットしてください。

ベースライン補正後のデータをプロットし、2 9 3 T細胞の一過性トランスフェクションと細胞株への感染における振幅と位相を比較します。トランスフェクションおよびトランスダクションされたGFP発現細胞の蛍光画像は、レンチウイルスを介した遺伝子導入システムが非常に効率的であることを示しています。概日時計のコアフィードバックループは、概日エンハンサーエレメントに作用してリズムのある遺伝子発現を生じさせる転写因子で構成されています。

ここでは、3種類のT three細胞における4つの異なるレポーター構築物が、それぞれ異なるレポーター発現相を産生します。RNAiによる遺伝子ノックダウンおよび薬理活性化合物を用いて、複数の概日リズム要素によって組み合わせ的に制御することで、新たな中間相を生成することが可能です。本実験では、35 mmディッシュで培養したU2 OS細胞の生物発光記録に、lum cycleルミノメーターを使用しました。

cry oneおよびcry two遺伝子のノックダウン効果を明らかにするために、Irnaが用いられました。ここでは、細胞の生物発光を記録するためにシナジールミノメーターが使用されました。96ウェルプレート内で、3つのT3レポーター細胞を用いて行われました。

細胞リズムに対するtriuneノックダウンの影響を評価するために、RNAが使用されました。この例では、UXシステムとTecanルミノメーターを用いて、384ウェルプレート内の細胞の生物発光記録が行われました。選択されたプレートにおいて、低分子化合物を用いて、U2 OSレポーター細胞の細胞リズムにおけるタンパク質機能を薬理学的に標的化し、摂動させることができます。

本手法の開発後、概日生物学の分野における研究が加速し、さまざまな細胞や組織における時計メカニズムと生理学的機能の探索が可能となりました。このビデオを視聴することで、ルシフェラーゼ・リポーター細胞株の作製方法およびその活性のモニタリング方法について深く理解することができます。

また、ウイルスを取り扱う操作は極めて危険を伴う場合があることを忘れず、本手順の実施に際しては、個人用保護具の着用やウイルスの除染などの予防措置を常に講じてください。