フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

本実験の目的は、フローサイトメトリーを用いてマウスにおける胸腺の発達を調べることです。これは、マウスの胸腺および脾臓から単一細胞懸濁液を調製することで達成されます。次に、特定の胸腺細胞集団を同定するため、胸腺細胞および脾細胞を抗体カクテルで染色します。

最終的に、さまざまなリンパ球集団の頻度と数は、フローサイトメトリー解析によって評価することができます。この手法は、機能的かつ自己寛容なT細胞レパートリーを形成するためにどの遺伝子や経路が重要であるかなど、T細胞分化における主要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は胸腺におけるT細胞分化に関する知見を提供しますが、他の免疫細胞の分化の検討にも適用可能です。

一般的に、この方法に不慣れな方は、フローサイトメトリー用の抗体カクテルの設計に苦慮することがあります。解剖を開始する前に、60×15 mmのペトリ皿に滅菌済みのスチールメッシュスクリーンを配置してください。次に、皿に5 mLのHBSSを加え、胸腺を採取するために皿を氷上に保管します。

まず、ピンセットを用いて胸骨の下端を持ち上げ、横隔膜を露出させます。次に、肝臓を避けながら横隔膜を切開して肋骨を切り離し、肺と心臓を傷つけないように注意しながら、両側の肋骨を上方に向かって切断します。

次に、鉗子を用いて肋骨を慎重に押し広げます。胸腺は心臓の上に位置する白い2葉の器官です。鉗子の平らな端を使用して、葉の下端を把持します。

次に、胸腺を慎重に引き出し、あらかじめ準備したメッシュスクリーンの一つの上に置きます。脾臓を採取するには、腹膜を切開して腹腔を露出させます。脾臓は、マウスの腹腔内の左側、肝臓の下にある、赤いサーフボードのような形状の器官です。

次に、1組のピンセットで脾臓を取り出し、別のピンセットで結合組織を切り離します。その後、摘出した脾臓を別のメッシュスクリーン上に置きます。3 mLシリンジのプランジャーを使用して、結合組織と脂肪だけが残るまで、各臓器をメッシュスクリーン上ですり潰します。細胞とHBSSをピペットで吸い上げ、15 mLコニカルチューブに移します。

次に、各メッシュを新鮮なHBSで3回洗浄します。続いて、335 ×g、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を吸引した後、脾臓の赤血球を溶血させるため、細胞を500 µLのCK溶解バッファーに懸濁し、室温で10分間放置します。

胸腺細胞をFAXバッファーを用いて20 × 10⁶ cells/mLに懸濁し、氷上に置いておきます。次に、細胞を再度遠心分離した後、5 mLのHBSSを加えて細胞を等張性に的に戻します。赤血球を除去したペレットを、FAXバッファーを用いて20 × 10⁶ cells/mLに再懸濁します。このステップは、分注することから始めてください。

96ウェルプレートの各ウェルに、フローサイトメトリーサンプル1つあたり 4 × 10⁶ 個の分離したTHYMOCYTESを分注します。次に、コンペンセーションコントロール用に、96ウェルプレートのウェルに細胞を添加します。その後、各細胞サンプルをanti CD 16/32で氷上10分間インキュベートし、FC受容体をブロッキングします。

次に、プレートをスピンダウンさせ、プレートを一度シンクに向けて裏返しに弾いてウェル内の液体を除去します。その後、各ウェルに200 µLのfax bufferを加えて再懸濁し、洗浄を繰り返します。次に、実験試料を200 µLの抗体カクテルで、コンペンセーションコントロール用の試料を単一の蛍光色素標識抗体でインキュベートします。すべてfax bufferを用い、氷上で遮光して行います。

30分後、細胞を FACS バッファーで2回洗浄し、その後、細胞を FACS バッファーに再懸濁して、生理的な TCR 導入マウスおよび野生型マウスのサンプルを FACS チューブに移します。ポジティブセレクションは、ダブルポジティブ（DP）ブライト段階から始まり、その後ダブルポジティブ（DP）ダル段階へと移行します。抗原との遭遇後、ダブルポジティブ（DP）ダルの胸腺細胞は、CD4 正系 CD8 低発現の移行段階を経て、CD4 正系となります。

シングルポジティブ（SP）またはCD8シングルポジティブ胸腺細胞（成熟シングルポジティブ胸腺細胞）は、高いTCR発現とCD24の消失によって特徴付けられます。CD8とCD4のプロファイルから正の選択の欠損を明らかにできますが、TCRβとCD69またはCD5を解析することで、欠損部位についてさらなる知見を得ることができます。CD69とCD5はともにTCR刺激後にアップレギュレートされ、相互作用が強いほどこれらのマーカーの発現が高まります。

野生型マウスにおけるこのTCR β対CD69のプロットでは、TCR β low CD69 negativeのゲートは、選択前のダブルポジティブ胸腺細胞の集団を表しています。一方、このTCR β intermediate CD69 positiveのゲートは、TCR結合直後の移行期集団を表しており、ダブルポジティブbrightの一部にダブルポジティブdullおよびCD4 positive CD8 low細胞が含まれます。ここでは、TCR β high CD69 positiveのゲートが、ポジティブ選択直後の細胞集団を示しており、これらはダブルポジティブdull、CD4 positive CD8 low、およびCD4シングルポジティブ細胞で構成されています。

最終的に、このTCR β high CD69 negativeゲートでは、主にCD4およびCD8シングルポジティブ細胞で構成される、より成熟した細胞集団が示されています。TCR β intermediate CD69 positiveおよびTCR β high CD69 positive集団の欠如は、ポジティブセレクションの障害を示唆している可能性があります。また、TCR β high CD69 negative集団内におけるCD4シングルポジティブ細胞とCD8シングルポジティブ細胞の比率の変化は、リネージ決定の変異を示唆している可能性があります。

TCR β high CD69 positiveおよびTCR β high CD69 negative集団の消失は、正の選択後の生存上の問題を反映している可能性があります。CD5によるTCR βの検討は、正の選択前および選択後の集団を特定するためのもう一つの戦略です。これら最初の2つの集団は、主にdouble positive bright胸腺細胞で構成されています。

TCR β low CD5 low集団は選択前のダブルポジティブ胸腺細胞を表し、TCR β intermediate CD5 intermediate集団はポジティブセレクションを開始する細胞で構成されています。この集団または前段階の集団の生成不全は、ポジティブセレクションの欠損を示唆します。一方、TCR β intermediate CD5 high集団は、ポジティブセレクションの過程にある胸腺細胞を表しており、主にダブルポジティブ dullおよびCD4ポジティブ細胞で構成されています。

CD8 low胸腺細胞。TCRβ highかつCD5 highの集団は、主に正の選択後から構成されます。シングルポジティブ胸腺細胞におけるCD4シングルポジティブとCD8の比率の変化。

先行する集団が正常であるにもかかわらず、この集団内にシングルポジティブ細胞が存在することは、系統決定の変異を示唆している可能性があります。さらに、この集団が欠如している場合は、ネガティブセレクションにおいて少数の抗原特異的集団が除去されるため、ポジティブセレクション後の胸腺細胞の生存率が低下していることを示している可能性があります。このプロセスの欠陥を観察するには、TCRトランスジェニックマウスを用いるのが最適であり、HY CD4マウスの胸腺細胞で発現しているトランスジェニックH-Y-TCRは、モノクローナル抗体T 3.7を用いて検出可能です。

H-Y-T-C-Rは、MHCクラスI db内で提示されるオス特異的なHY抗原を認識します。したがって、HY CD4オスマウスでは、T 3.70陽性のダブルポジティブ胸腺細胞数の減少、およびさらに顕著なT 3.7陽性CD8シングルポジティブ胸腺細胞数の減少によって示されるように、H-Y-T-C-R陽性胸腺細胞のネガティブセレクションが起こります。対照的に、HY CD4メスマウスでは、T 3.7陽性CD8シングルポジティブT細胞を生成するためのポジティブセレクションが起こります。

ダブルポジティブ胸腺細胞数の減少は負の選択を示唆しますが、抗原特異的なシングルポジティブ胸腺細胞の消失が最も正確な指標となります。HY CD4マウス（雄）における少数のT3.70陽性CD8シングルポジティブ胸腺細胞をさらに検討すると、その大部分がCD24高発現の未熟細胞であることがわかります。一方、HY CD4マウス（雌）におけるT3.70陽性CD8シングルポジティブ胸腺細胞の大部分は成熟に達しておりCD24低発現であることから、HY CD4マウス（雄）において負の選択が起こっていることがさらに裏付けられます。

TCRトランスジェニックモデルにおける一つの注意点は、胸腺細胞の発達過程全体を通じてTCRが高発現しているため、TCRおよびCD69またはCD5の発現に基づいて集団を特定し、正の選択をさらに詳細に解析することが困難である点です。HY CD4雌マウスでは、正の選択を受けるT3.70陽性のダブルポジティブ胸腺細胞の大きな集団が存在します。野生型と比較してCD69陽性集団が増加していることからわかるように、負の選択には正の選択よりも高い親和性のTCR刺激が必要です。これは、HY CD4雄マウスのT3.70陽性ダブルポジティブ胸腺細胞においてCD69の発現が高く、その結果としてヒストグラムのピークが右方にシフトしていることから示されています。

遺伝子操作マウスにおける胸腺選択を解析すると、CD5の発現においても同様の傾向が見られます。CD69またはCD5の発現を調べることで、欠損がTCRシグナル伝達にあるのか、あるいはTCR刺激の下流の結果にあるのかを判断できます。この手法に習熟すれば、細胞調製と染色は2時間半、さらにフローサイトメーターでのデータ収集に1時間をかけて実施することが可能です。

正しく行えば、マウス1匹を追加するごとに約30分かかります。この手順を実施する際は、胸腺細胞を優しく扱うこと、および染色戦略を事前に計画しておくことが重要です。以下の手順に従ってください。

輸出された胸腺細胞が適切に機能しているかなど、さらなる疑問を解消するために、細胞傷害試験やサイトカイン産生試験などの他のアッセイを実施することができます。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いて胸腺部位の発達を分析する方法について十分に理解できたはずです。