蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

この手法では、不活性なPEG分子とビオチン化PEG分子の混合物を用いて、ガラスカバースリップを機能化します。この機能化された表面を用いてフローセルを作製し、TIRF顕微鏡上に設置します。次に、多価ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化されたローリングサークルテンプレートを表面に結合させます。

repli zoneタンパク質とヌクレオチドの添加により基質が複製されると、得られた二本鎖DNAは層流によって伸長され、インターカレーション染料を用いてリアルタイムでイメージングされます。ハーバード大学医学部生物化学・分子薬理学部のAntoine Van Nostrand研究室のNathan Tannerです。同じくVan Nostrand研究室のJoe Laroです。

本日は、単一分子レベルでのDNA複製をリアルタイムで観察する蛍光イメージングの手法について解説します。当研究室では、個々の複製複合体による協調的なDNA合成活性を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。

本手順を開始するために、TBSバッファー中で10倍量のオリゴを加え、65 °Cまで加熱した後、ヒートブロックの電源を切って徐冷させることで、ビオチン標識テイルオリゴをM 13一本鎖DNAにアニールさせます。プライマーをアニールさせたM 13が準備できたら、これをdNTPsと塩化マグネシウムを含むT7複製バッファーおよび64 nMのT7 DNAポリメラーゼの混合液に加え、反応液を37 °Cで12分間インキュベートします。インキュベーション終了後、100 mM EDTAで反応を停止させます。

次に、充填された産物DNAをフェノール・イソアミルアルコール・クロロホルム抽出で精製し、TEバッファーまたはその他の適切な保存バッファーで透析します。各有機相を逆抽出して、残留しているプライミング済みM13を回収してください。透析後、UV-vis分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。テンプレート調製を1回行うことで、数百から数千回の単一分子実験に十分なナノモーラー濃度のテンプレートを作製することが可能です。

DNAの準備が整いましたので、機能化カバーガラスの作製に進みます。複製されるDNAは、Amil Laneで機能化されたガラスカバーガラスに結合させます。AmilのOxy基がガラスに結合し、アミノ基がビオチン化PEG分子との結合に利用可能な状態で残ります。このコーティングにより、表面への非特異的結合を低減させることができます。

ガラスカバースリップを十分に洗浄するため、染色瓶に入れてエタノールを満たし、30分間ソニケーションします。その後、瓶の中をすすぎ、1 M 水酸化カリウム溶液を満たして30分間ソニケーションします。これら両方の洗浄工程を繰り返します。最初の機能化反応を行う前に、すべての水分を完全に除去する必要があります。

染色瓶にアセトンを満たし、10分間超音波処理します。瓶の中身を捨て、再びアセトンを満たします。続いて、染色瓶にsine試薬を加え、2分間撹拌します。

次に、大過剰の水でクエンチします。その後、カバーガラスをオーブンで110 °Cで30分間加熱して乾燥させます。次に、約0.2% w/vのPEG混合液を調製します。ガラスカバーガラススペーサーを含めることでカバーガラスを分離させることができ、乾燥したシリライズドカバーガラス上に100 µLをピペットで滴下します。

2枚目のカバーガラスを上に重ねます。カバーガラスをPEG溶液中で3時間インキュベートします。その後、カバーガラスのペアをそれぞれ分離し、水で十分に洗浄します。

PEGがコーティングされているのは片面のみであるため、カバーガラスの機能化された面を上に向けて保持するように注意してください。最後に、圧縮空気でカバーガラスを乾燥させ、デシケーター内で真空保存します。表面は少なくとも1か月間は安定したまま維持されます。したがって、一度に数十枚のカバーガラスを作製し、必要に応じて使用することが可能です。

カバーガラスの準備が整いましたので、単一分子実験用のフローチャンバーを組み立てます。まず、後の工程で気泡を除去するため、BSAを含むブロッキングバッファー 20～25 mLをデシケーターに入れます。次に、25 µLのストレプトアビジンを100 µLのPBSで希釈し、PEG修飾されたカバーガラスの表面に溶液を広げます。チャンバーの他の部品を準備している間に、ストレプトアビジンが表面のビオチンに結合するように、室温で20分間インキュベートします。

カバーガラスのインキュベーション中に、フローチャンバーの組み立てに使用した石英スライドのサイズに合わせて、両面に剥離紙がある両面テープをカットします。フローチャンバーの輪郭がテープ上に描けるよう、チューブ穴の位置を鉛筆でテープにマークします。穴の位置をマークした後、その印の周囲に幅2 mmの長方形を描きます。

この長方形が流路となりますので、側面を直線的にし、チューブの入口と出口の周囲に十分なスペースを確保してください。次に、描いた輪郭に沿って印を付けたテープを切り、接着剤がチャネル内に突き出さないよう、直線的にきれいにカットします。アセトンを使用して石英スライドを徹底的に洗浄し、以前の実験で使用したフローセルの構築時に付着した接着剤を除去してください。

チャンネル外形の最適な位置を確認します。粘着面の一方の剥離紙を剥がし、コートスライドの上にテープを慎重に貼り付けます。入口および出口の穴が塞がらないよう、テープの位置を正確に合わせることに注意してください。

次に、フローセルの入口および出口に使用する0.76 millimeterのチューブを適切な長さに切断して準備します。チューブの端を約30度の角度で切断すると、チューブがチャンバーの底に押し付けられて平らになるのを防ぐことができます。次以降のステップでフローセルに簡単に取り付けられるよう、チューブを試験管ラックに吊るしておきます。

これでカバーガラスのインキュベーションが完了しました。ストレプトアビジンENCコーティングされたカバーガラスを水で十分に洗浄し、圧縮空気を用いて乾燥させます。機能化されているのは片面のみであるため、カバーガラスを裏返さないように注意してください。

最後に、テープの裏面のもう一方を剥がし、クオーツスライドをカバーガラスの上に配置して、フローチャンバーの組み立てを完了させます。カバーガラスを軽く押し、粘着剤に閉じ込められた空気を押し出します。これにより、フローチャネル内に気泡が混入するのを防ぐことができます。

エポキシ樹脂を用いてチャンバーの側面を密封します。切断したチューブを石英の穴に挿入し、エポキシ樹脂で固定して数分間乾燥させます。エポキシ樹脂の密封が完了したら、表面のブロッキングを開始します。

21ゲージの針を使用します。Degasブロッキングバッファーをチューブのいずれかから吸い上げます。気泡を取り除くために数回フラッシュし、単一分子複製実験に進む前に、チャンバーを少なくとも30分間インキュベートしてください。

フローセルを封止したので、顕微鏡ステージ上に配置します。ステージクリップでチャンバーを固定し、フローチャネルがy軸に沿って配置されていることを確認してください。フローセルの流出口チューブを、より大径のコネクターチューブを用いてシリンジポンプに接続します。

インレットをブロッキングバッファーに浸し、シリンジを引いてチューブ内の空気を除きます。アウトレットチューブを軽く弾くと、フローセル内に閉じ込められた気泡を除去しやすくなります。次にDNAを添加します。ストックDNAテンプレートをブロッキングバッファーで25 picomolarに希釈し、1 milliliter分を、DNAが表面を十分にカバーできるよう、0.025 milliliters per minuteなどの適度な流速で30分間チャンバー内に流します。

DNAをチャンバーに導入した後、ブロッキングバッファーを用いて、フローセル容積の少なくとも200倍量で過剰なDNAを洗い流します。遊離DNAを完全に除去するため、レーザーとカメラをオンにします。冷却CCDは、使用前に設定温度に達する必要があります。

過剰なDNAを洗い流し、複製バッファーの脱気を行った後、ヌクレオチド、DTT、cytoxin、および複製バッファーを用いて複製反応混合液を調製します。次に、タンパク質を加えて穏やかに混合します。その後、反応混合液をフローセルに流します。

ここでの流速は、幅 2 mm、高さ 100 µm のフローチャネル内で、2本鎖 DNA を伸長させるのに十分である必要があります。0.04 mL/min が適しています。混合液がチャンバーに流入するまで、約 10 分間の時間を設けてください。

視野をチャネルの側面に移動させ、接着剤にピントを合わせることで、フォーカシングのための表面近辺に位置していることを確認し、イメージングを開始します。レーザー強度、顕微鏡のフォーカス、およびturf angleを調整してください。染色されたDNAの光切断を避けるため、レーザー強度は低く維持してください。

DNA複製の速度に応じて、1秒間に1〜5フレームの速さで数分間撮影します。より長い複製軌跡を得るにはこの操作を繰り返し、反応混合物のほぼすべてが細胞内に注入された場合は、cytを含むバッファーをさらに流して新しい視野に移動し、より多くの分子を観察します。異なる複製分子の画像を複数撮影することで、生産性を決定するための統計データを得ることができます。

ローリングサークル複製アッセイにおいて、リーディング鎖の合成により、サークルと表面を連結するテールが伸長します。このテールは、ラギング鎖ポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、図に示すように層流によって引き伸ばされます。ここでは、532 nanometerでの励起によるCy3 orangeの視野例を示します。

小さな蛍光スポットは、係留された未複製の基質です。産物の極めて長い長さと、1視野あたりの産物の多さに注目してください。典型的な視野では、染色されたDNAが明るい線として伸長していく、多数の複製分子が観察されます。37 °CでのE Coli実験では、表面密度に応じて、1視野あたり5〜50個の分子が観察されます。

T7複製領域はより効率的に開始され、視野内の分子の50%以上が複製されます。これほど高密度になると、ここで見られるように個々の分子を識別することが困難になります。そのため、T7の実験はより低いタンパク質濃度または表面密度で実施してください。E. coliおよびT7実験における典型的な複製分子のChimeグラフには、時間に対するE. coliおよびT7分子のエンドポイント軌跡が含まれています。これらの軌跡を線形回帰でフィッティングして複製速度を算出しており、この例ではE. coliが467.1 base pairs per second、T7が99.4 base pairs per secondとなっています。

T7について、単一分子トラジェトリの速度分布を単一ガウス関数でフィッティングした結果、平均速度はe coliで535.5 ± 39 base pairs per second、G7で75.9 ± 4.8 base pairs per secondとなりました。T7における複製産物の長さ分布は、単一指数関数減衰でフィッティングして生産性を算出したところ、e coliで85.3 ± 6.1 kilobase pairs、G7で25.3 ± 1.7 kilobase pairsとなりました。以上で、単一分子を用いた協調的DNA複製の測定方法について説明しました。

この手順を行う際は、カバーガラスを適切に機能化し、クリーンで直線的なフローチャネルを作成することが重要です。レーザー出力は低く抑え、長いDNAの光切断を最小限にするようにしてください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。