腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録

本手順の全体的な目的は、生体内で運動ニューロンの細胞内記録を行うことにより、単一のマウス運動単位の電気生理学的および収縮特性を研究することである。まず、脊髄および目的の筋肉を露出させ、次に筋肉の腱に力変換器を取り付けることでこれを達成する。

次に、細胞内電極で運動ニューロンを刺激し、記録した運動単位の収縮を誘発させます。これにより、最終的に運動ニューロンの電気生理学的特性を、その運動単位の収縮特性と同時に評価することが可能になります。動物のサイズが非常に小さいため、マイクロサージャリーの手順を習得することは非常に困難であり、この手法を視覚的に示すことは極めて重要です。

手順を開始するために、ペントバルビタールナトリウム、またはケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与してマウスを麻酔します。マウスに足指つまみ反射がないことを確認してください。次に、鈍端剪刀を用いて気管上の皮膚を切開し、皮膚を両側に引っ張って広げます。

次に、鈍端鑷子を用いて唾液腺を引き剥がします。気管を覆っている2本の細い筋肉を露出させるため、これら2本の筋肉を分離して気管を露出させます。この際、Dumont No.7鑷子を使用してください。

4-0のシルク縫合糸2本を気管の下に通します。次に、2つの軟骨環の間で気管を横方向に切開します。ただし、気管を完全に切断しないように注意してください。

次に、気管チューブを気管内に挿入します。挿入部位の両側を縫合糸で結び、固定します。その後、気管チューブをマウス用人工呼吸器とカプノグラフに接続します。

次に、コンプライアンスバッグを介して人工呼吸器を純酸素に接続します。マウスが人工呼吸に抵抗せず、呼気終末二酸化炭素分圧が4%から5%の間で安定するように、人工呼吸器のパラメータを調整します。このステップでは、鈍的剥離の手法を用いて、頸部の片側の頸静脈を露出させます。

頸静脈は、前顔面静脈と後顔面静脈の2つの主要な幹に分かれています。静脈を周囲の結合組織から慎重に剥離します。次に、6-0のシルク縫合糸2本を静脈の下に滑り込ませ、静脈の長さに沿って可能な限り離して配置します。

次に、静脈の近位側に小さな血管クリップを装着し、遠位側を結紮します。極細のアイリス剪刀を用いて、静脈に小さな横切開を加えます。この際、静脈を完全に切断しないよう十分に注意してください。

その後、あらかじめ充填された1 Frenchカテーテルを、静脈とカテーテルを一緒に固定している血管クリップまで開口部に挿入します。血管クリップを注意深く取り除きます。次に、カテーテルを静脈内へさらに数ミリメートル押し込みます。挿入箇所の両側を縫合糸で結んでカテーテルを固定します。

次に、カテーテルのいずれかをシリンジまたはシリンジポンプに接続し、ペントバルビタールナトリウムやケタミン・キシラジンなどの麻酔剤を追加投与します。別の静脈に対しても同様の手順を繰り返し、もう一方のカテーテルをシリンジポンプに接続して、1%重曹と14%プラズモンを含む4%グルコース溶液を緩徐に静脈内投与します。最後に、頸部の皮膚を縫合糸と針で閉鎖します。

その後、マウスを腹臥位に戻します。次に、大腿部上端からアキレス腱にかけて切開します。皮膚を下の筋肉から剥離させ、血管を損傷しないように注意してください。

次に、大腿部を縦に走る白い線として現れる大腿二頭筋の前縁を特定します。その後、膝から骨盤まで、その線に沿って慎重に切開します。筋肉を分離し、大腿二頭筋の下にある坐骨神経を露出させます。

大腿二頭筋を慎重に剥離して除去します。坐骨神経と三頭筋（腓腹筋）を露出させるため、総腓骨神経と外側皮神経の間にある脛骨神経を確認します。脛骨神経のさまざまな分枝の中から、より深層へ向かう分枝と区別し、三頭筋（腓腹筋）を支配する分枝を特定します。

8 OTTのシルク糸を用い、三頭筋への神経枝を温存しながら、脛骨神経のすべての枝をまとめて結紮します。結紮点からできるだけ離れた位置で脛骨神経を切断します。第13胸椎（T 13）と第1腰椎（L one）を特定します。なお、T 13は肋骨が付着している最後の椎骨です。

次に、T 13とL 1の両側にCunningham脊髄椎体クランプを使用して、脊柱を固定します。この際、脊髄を圧迫しないように注意し、縦軸方向にわずかに張力をかけます。ピンセットで軽く押し下げ、脊柱がしっかりと固定されていることを確認してください。

微細なRジュラース（R jurors）を用いて、T13およびL1上の棘突起と椎弓を除去し、脊髄を露出させます。次に、特製のプラスチック製バスを配置して脊髄を囲みます。その後、4-0シルク糸を用いてバスを固定します。

最後に、クイックキャスト密封剤で密封し、バスの防水性を確保します。クイックキャストが乾燥したら、脊髄を覆っている綿を取り除き、バスにミネラルオイルを満たします。別の椎体クランプを使用して、仙骨領域の棘突起を固定します。

動物の背部を支持するために、3つ目のクランプを用いて右後肢を固定します。この際、膝関節と足関節をそれぞれ 90°に屈曲させてください。後肢領域を覆っているガーゼを取り除きます。アキレス腱を周囲の組織から剥離します。

絹糸の縫合糸（6-0）をアキレス腱に通し、腱の周囲に三重結びを作ります。その後、結び目の近くに力変換器を配置します。

その後、絹糸を用いて腱をフォーストランスデューサーに固定し、腱の遠位端を切断します。次に、三頭筋の筋膜下に2本のステンレス鋼線を挿入します。これらの電線は細胞外ACアンプに接続されています。

EMG記録を行うには、三趾腓骨神経をフック電極のカソードに配置し、アノードを近接する筋肉に接触させます。次に、最大収縮振幅が観察されるまで、低周波で強度を上げながら50 microsecondの方形パルスを用いて三趾腓骨神経を刺激します。その後、最大収縮振幅が観察されるまで、低周波で強度を上げながら50 microsecondの方形パルスを用いて三趾腓骨神経を刺激します。

これらの図は、三頭筋群から運動ニューロンを同定する方法を示しています。低強度の刺激で刺入した後は、より高い強度においてのみ単シナプス性EPSPが観察されます。さらに刺激強度を高めると、EPSPが十分に大きくなり、全か無かの原理に従って正方向のスパイクを誘発する可能性があります。

逆行性スパイクは、単シナプス性EPSPよりも短い潜伏期で現れます。マイクロ電極からスパイクを誘発するのに十分な電流を注入すると、短い遅延の後に筋肉でEMG活動が記録され、それに続いて筋収縮が起こります。

運動ニューロンを特定した後、その電気生理学的特性を評価することができます。例えば、この図は、過分極および脱分極電流パルスを用い、注入電流量に対する膜電位の変化をプロットすることで、入力抵抗をどのように測定できるかを示しています。また、さまざまな刺激プロトコルを用いて、運動単位の収縮特性を調べることも可能です。

例えば、運動ニューロンにさまざまな周波数で短パルスの電流を注入することで、力-周波数関係を得ることができます。その後、定常状態の力を電流パルスの周波数に対してプロットすると、シグモイド状の力-周波数曲線が現れます。手術に習熟すれば、適切に行った場合にこの手法の一部を3時間で完了させることができます。